Оставьте ссылку на эту страницу в соцсетях:

Поиск по базе документов:

 

Утверждаю

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека,

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

6 августа 2007 года

 

Дата введения:

1 октября 2007 года

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК И СПОР

BACILLUS SUBTILIS 24Д - ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ФУНГИЦИДА "ИНТЕГРАЛ"

В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.2.2233-07

 

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благополучия человека (протокол от 29 марта 2007 г. N 1).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 августа 2007 г.

3. Разработаны ОАО "Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ".

4. Введены в действие с 1 октября 2007 г.

 

1. Общие положения и область применения

 

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток и спор штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций 10 - 50000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе производственных помещений биотехнологического цеха и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 ГСИ "Методики выполнения измерений".

 

2. Биологическая характеристика штамма

Bacillus subtilis 24Д

 

Штамм Bacillus subtilis 24Д (ВНИИСХМ 129) является действующим веществом микробиологического фунгицида "Интеграл". Выделен из растений хлопчатника. Идентифицирован в Институте микробиологии и вирусологии НАН Украины.

Штамм Bacillus subtilis 24Д характеризуется следующими культурально-морфологическими и биохимическими свойствами: грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. На МПА, сусло-агаре, среде Громыко и картофельном агаре культура растет обильно. На МПА образует складчатые колонии вязкой консистенции, телесного цвета, края колонии неправильной формы. На картофельном агаре - колонии светло-телесного цвета, блестящие, вязкой консистенции края ровные. На сусло-агаре и среде Громыко - колонии телесного цвета, складчатые, с возвышающимся центром, края - изрезанные, консистенция - вязкая.

В мазках 18-часовой культуры обнаруживаются прямые палочковидные клетки размером 1,9 x 0,5 мкм, расположенные одиночно, реже цепочкой. При спорообразовании клетка не раздувается. Споры эллипсовидные - 0,9 x 0,5 мкм, в клетке расположены центрально.

Штамм Bacillus subtilis 24Д ферментирует глюкозу, лактозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты; не разлагает дульцит, рамнозу; дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, гидролизует крахмал, желатин, не гидролизует мочевину; утилизирует цитрат; пропионат не использует. Не растет в анаэробных условиях, не образует включения поли-бета-оксимасляной кислоты на МПА с глюкозой; не обладает летициназной активностью; индол и сероводород не образует. Штамм не патогенен.

Штамм Bacillus subtilis 24Д проявляет антагонистическую активность в отношении фитопатогенных грибов классов фикомицеты, базидиомицеты класса несовершенных грибов, бактерий родов Erwinia, Pseudomonas и Xanthomonas.

Штамм Bacillus subtilis 24Д размножают и хранят на МПА, сусло-агаре, среде Громыко, картофельном агаре. Рост при температуре 32 - 34 °C в течение 24 ч.

Для обнаружения штамма применяют посев проб на агаризованные питательные среды с последующим тестированием культуры по типичным морфологическим признакам.

 

3. Пределы измерений

 

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток и спор штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 10 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

 

4. Метод измерений

 

Метод измерения концентрации основан на аспирации микробных клеток и спор штамма Bacillus subtilis 24Д из воздуха на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

 

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,

реактивы и материалы

 

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.

 

5.1. Средства измерений, вспомогательные

устройства, материалы <*>

 

--------------------------------

<*> Допускается использование аналогичных средств измерений и вспомогательных устройств с техническими характеристиками не ниже, чем у указанных в п. 5.1 данной методики и разрешенных к применению в соответствии с утвержденными в установленном порядке методическими указаниями по методам контроля.

 

Прибор для бактериологического анализа воздуха,

модель 818 (щелевой прибор Кротова)                          ТУ 64-12791-77

Термостат электрический суховоздушный                        ГОСТ 9586-75

Автоклав электрический

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной

системой типа "Биолам" Л-211

Водяная баня или водяной термостат

Ареометр-сахарометр АСТ 5-15

pH-метр

Газовая горелка или спиртовка лабораторная

Чашки Петри плоскодонные стеклянные, диаметром 10 мм         ГОСТ 25336-92

Петли бактериологические

Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл               ГОСТ 29227-91

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                               ГОСТ 29227-91

Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл                   ГОСТ 1770-74

Секундомер                                                   ГОСТ 9586-75

Барометр                                                     ГОСТ 24696-79

Марля медицинская                                            ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая                            ГОСТ 25556-81

 

5.2. Реактивы, питательные среды и их компоненты <*>

 

--------------------------------

<*> Допускается использование питательных сред и их компонентов, изготовленных по другой нормативной документации, при условии аналогичного состава и качественных показателей не ниже, чем у указанных в п. 5.2 данной методики.

 

Агар микробиологический                                  ГОСТ 17206-96

Концентрат сусла пивного неохмеленного                   ТУ 10-04.06.114-88

Вода дистиллированная                                    ГОСТ 6709-72

Натрия гидроокись, ч.                                    ГОСТ 4328-77

Амфотерицин B                                            ФС 42-2051-99

Мясо-пептонный бульон                                    ГОСТ 20730-75

 

6. Требования безопасности

 

При выполнении измерений концентрации клеток и спор штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе рабочей зоны соблюдают правила техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88;

- правила электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов;

- требования, изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980);

- положения "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу, при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

 

7. Требования к квалификации оператора

 

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

 

8. Проведение измерения

 

8.1. Условия отбора проб воздуха

 

Для определения концентрации микроорганизма производят отбор проб воздуха при помощи аппарата Кротова (п. 5, примечание 1) со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды. Время отбора одной пробы воздуха 20 мин. Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы. В период отбора пробы воздуха крышку чашки Петри хранят в стерильном пакете из бумаги, полиэтилена или другой стерильной емкости.

Отбор проб сопровождается составлением акта отбора пробы с указанием места, времени и условий отбора.

 

8.2. Выполнение анализа

 

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3 - 4-е сут. после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний.

Подготавливают питательную среду: сусло-агар или среду Громыко. Сусло-агар готовят по общепринятой методике из концентрата сусла пивного неохмеленного (п. 5.2) путем разбавления его дистиллированной водой до общей концентрации сахаров 10% (10° Баллинга), pH 7,0 - 7,2 (при необходимости pH доводят до необходимого значения путем добавления 10%-го раствора гидроокиси натрия) с добавлением 2,0 - 2,5% агар-агара. Среду Громыко готовят по общепринятой методике из мясо-пептонного бульона и сусла пивного неохмеленного с концентрацией сахаров 7% (7° Баллинга), взятых в соотношении 1:1, с добавлением 2,0 - 2,5% агар-агара, pH-среды 7,0 - 7,2. Общую концентрацию сахаров в сусле определяют по ареометру.

Подготовленную среду расплавляют на водяной бане, остужают до 50 - 60 °C и добавляют в нее раствор амфотерицина B в стерильной дистиллированной воде из расчета 10 мкг амфотерицина В на 1 мл питательной среды для подавления посторонней воздушной микофлоры.

У каждой партии подготовленной питательной среды проверяют ростовые свойства. Используемые питательные среды должны обеспечивать рост микроорганизмов Bacillus subtilis 24Д при посеве их в количестве менее 100 жизнеспособных клеток не позднее 24 ч при температуре 32 - 34 °C.

Готовую питательную среду тщательно перемешивают и разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри, установленные на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 30 - 35 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

Культивирование проб воздуха, отобранных согласно п. 8.1, ведут в течение 24 ч при температуре 32 - 34 °C с последующим учетом выросших типичных колоний штамма Bacillus subtilis 24Д. При необходимости выросшую культуру подвергают микроскопической идентификации (окраска мазков - по Граму).

 

9. Вычисление результатов измерения

 

Расчет концентрации клеток в перерасчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

 

К = (П x 1000) x С x Т,

 

где:

К - концентрация штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе, кл./куб. м;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент перерасчета на 1 куб. м воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин.;

Т - время аспирации, мин.

 

10. Оформление результатов измерений

 

Результаты измерений оформляют протоколом по приведенной форме.

 

Протокол N __

оценки содержания микроорганизма Bacillus subtilis 24Д

в воздухе рабочей зоны

 

    1. Дата проведения анализа ____________________________________________

    2. Рабочее место (профессия работающего) ______________________________

    3. Место отбора пробы (название  и  адрес  организации,   производство,

технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________

___________________________________________________________________________

    4. Вид пробоотборника _________________________________________________

    5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора  проб

___________________________________________________________________________

    6. Питательная среда, время инкубации _________________________________

    7. Количественная  и   качественная   характеристика  выросших  колоний

(количество типичных колоний, морфологические признаки,  окраска по  Граму)

___________________________________________________________________________

    8. Результаты идентификации микроорганизмов с указанием метода ________

___________________________________________________________________________

    9. Результаты расчета концентрации Bacillus subtilis 24Д ______________

___________________________________________________________________________

    10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК    _______________

                                                        Р.З.

___________________________________________________________________________

    11. Отбор пробы проведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) ___________

___________________________________________________________________________

    12. Идентификация     штамма      и расчет     концентрации   проведены

(Ф.И.О., должность, дата, подпись) ________________________________________

 

Список литературы

 

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".

2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкция по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.

5. Государственная фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2. Общие методы анализа. М.: Медицина, 1990.

6. Р 2.2.2006-05 "Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда".

 

 



Мегабиблиотека по охране труда и технике безопасности. // Некоммерческий проект для инженеров по охране труда. //

Рейтинг@Mail.ru Яндекс цитирования

Copyright © www.УЦОТ.рф, 2012 - 2018