Оставьте ссылку на эту страницу в соцсетях:

Поиск по базе документов:

 

Утверждаю

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека,

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

9 июля 2010 года

 

Дата введения -

с момента утверждения

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК

ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ASPERGILLUS NIGER

ВКПМ F-171 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.2.2656-10

 

1. Разработаны Государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования "Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию", Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук (ГУ ВНИИПАКК РАСХН).

2. Рекомендованы Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 июля 2010 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

 

1. Общие положения и область применения

 

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171, селекционированного в ГУ ВНИИ пищевых ароматизаторов, кислот и красителей РАСХН (ГУ ВНИИПАКК), в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля концентрации конидий штамма Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе производственных помещений биотехнологического производства лимонной кислоты и оценки соответствия уровня их содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования", ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений" и Р 2.2.2006-05 "Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда".

Методические указания предназначены для применения в лабораториях организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

 

2. Биологическая характеристика штамма-продуцента

Aspergillus niger ВКПМ F-171 и его гигиенический норматив

 

Продуцент лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 относится к микромицетам. Уже на 2-е сутки на поверхности среды Чапека или сусло-агара при температуре 32 °C клетки (кл.) образуют округлые колонии диаметром 2,0 см с плоским субстратным мицелием, аспорогенные. На 5-е сутки роста они достигают максимального диаметра в среднем 8,1 см на среде Чапека и 8,6 см - на сусло-агаре. Окраска гигантской колонии бежевая - на среде Чапека, светло-бежевая - на сусло-агаре. Воздушный мицелий сильно развит: от поверхности субстратного мицелия вертикально поднимаются несептированные клетки - конидиеносцы. Минимальная длина конидиеносца 48 мкм, максимальная - 1265 мкм. Диаметр поперечного сечения конидиеносца - от 9 до 20 мкм. Верхний конец конидиеносца расширяется, образуя вздутие - пузырек диаметром от 20 до 60 мкм. От поверхности пузырька синхронно образуются цилиндрические выросты - стеригмы двуслойной структуры. От каждой стеригмы первого слоя отделяются, в основном, две вторичные стеригмы. Стеригмы первого слоя вдвое крупнее, чем стеригмы второго слоя. Длина стеригм первого слоя - от 6 до 32 мкм, второго слоя - от 5 до 10 мкм. Стеригмы второго слоя образуют цепочки конидий, созревание которых начинается на вторые сутки. Конидии имеют шарообразную форму, диаметр - 4,1 мкм, толстую пигментированную оболочку с шипами. Вздутие конидиеносца, стеригмы и конидии являются составляющими конидиальной головки, диаметр сечения которой колеблется от 44 до 132 мкм. В центре колонии конидиальные головки расположены плотно. От центра к краю колонии конидиальные головки мельче. По краю колонии в радиусе 0,5 см - на среде Чапека и 0,6 см - на сусло-агаре наблюдается светлая зона с незрелыми белыми конидиальными головками, плотно прижатыми к субстратному мицелию. Обратная сторона колонии гладкая, белая.

 

Систематическое положение микроорганизма

 

    Царство                                         Fungi

    Подцарство                                      Neomycota

    Отдел                                           Ascomycota

    Подотдел                                        Euascomycotina

    Класс                                           Plectomycetes

    Порядок                                         Hyphomycetales

    Род                                             Aspergillus

    Вид                                             Niger

    Штамм                                           ВКПМ F-171, ГУ ВНИИПАКК

 

Штамм Aspergillus niger ВКПМ F-171 получен в ГУ ВНИИПАКК методом мутагенеза из штамма Aspergillus niger Л-1 с использованием химических мутагенов и УФ-облучения в сочетании с отбором спонтанных вариантов и депонирован в ВКПМ как продуцент лимонной кислоты.

Штамм растет на жидких агаризованных средах. Оптимальная температура - от 28 до 32 °C. Для размножения используется сусло-агар (значение Баллинга 7°).

    Предельно  допустимая  концентрация  Aspergillus  niger  ВКПМ  F-171  в

                             3

воздухе рабочей зоны - 1 x 10  кл./куб. м, пометка А, класс опасности 3.

 

3. Пределы измерений

 

Методика позволяет выполнить измерения количества клеток продуцента лимонной кислоты в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м.

 

4. Метод измерений

 

Метод измерения концентрации конидий штамма-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 основан на аспирации из воздуха конидий микромицета на поверхность среды Чапека или сусло-агар, подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на 2-е сутки роста и контроля их развития на 5-е сутки роста.

 

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

 

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

 

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства

 

Импактор воздуха микробиологический

"Флора-100"                                                 ТУ 64-098-33-95

Термостаты электрические

суховоздушные типа ТС                                       ТУ 64-1-1382-76

Автоклав электрический

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой                                         ГОСТ 16317-87

Весы лабораторные аналитические ВЛА-200-М

Чашки Петри бактериологические

плоскодонные, стеклянные,

диаметром 100 мм                                            ГОСТ 25336-82

Колбы конические                                            ГОСТ 25336-82

Микроскоп биологический с иммерсионной

системой типа МБИ-15                                        ГОСТ 25706-83

Термометр

Прибор для определения влажности воздуха

 

5.2. Реактивы, растворы

 

Среда Чапека

(или сухой бакто-агар Czapek)                 ТУ 9229-014-00419789-95

                                              (или импортного производства)

Среда сусло-агар с массовой концентрацией

лимонной кислоты 1,0%                         ГОСТ 10444.1-84

Спирт этиловый ректификованный

из пищевого сырья                             ГОСТ Р 51652-2000

 

6. Требования безопасности

 

При выполнении измерений концентрации конидий продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны соблюдают:

- правила техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88;

- правила электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов;

- требования, изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980);

- положения инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (1977);

- санитарные правила по работе с микроорганизмами СП 1.3.2322-08;

- требования безопасности при работе с продуцентом лимонной кислоты, изложенные в инструкции по контролю производства лимонной кислоты (1997).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

 

7. Требования к квалификации операторов

 

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

 

8. Условия измерений

 

Измерение концентрации конидий штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны проводят с помощью прибора "Фора-100" при температуре окружающей среды от 0 до 50 °C и относительной влажности воздуха не более 80%.

 

9. Проведение измерения

 

9.1. Условия отбора проб воздуха

 

Определение концентрации конидий микромицета Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе производственных помещений проводят в результате их аспирации на плотную питательную среду Чапека или сусло-агар с последующей инкубацией в термостате и подсчетом выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

    Воздух  аспирируют  с  помощью  импактора  "Флора-100" в автоматическом

режиме  со  скоростью  10  куб.  дм/мин.  на  поверхность  среды Чапека или

сусло-агара  на  чашки  Петри.  Линейная  скорость  анализируемого  воздуха

автоматически   поддерживается   на  уровне,  позволяющем  осаждать  с  50%

эффективностью   частицы   диаметром  не  менее  1,4  мкм  (D  ).  Контроль

                                                             50

параметров  (заданный  отбираемый  объем воздуха, текущий отобранный объем)

осуществляется методом индикации.

Аспирацию воздуха проводят с интервалом 2 мин. и отбирают по 5 проб (через 2, 4, 6, 8 и 10 мин.) в каждой точке контроля. Выбор точек контроля определяется в соответствии с МУК 4.2.734-99.

Отбор проб сопровождается составлением акта отбора с указанием места, времени и условий отбора по форме:

 

                                    Акт

                                отбора проб

 

1. Дата, Ф.И.О. работающего (рабочее место) _______________________________

2. Профессия ______________________________________________________________

3. Предприятие (лаборатория, подразделение) _______________________________

4. Участок (технологическая стадия, операция) _____________________________

5. Место отбора (наименование рабочей зоны) _______________________________

6. Прибор для отбора проб _________________________________________________

7. Количество проб и точка их отбора ______________________________________

8. Условия отбора проб (объем прокаченного воздуха и время аспирации) _____

___________________________________________________________________________

9. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ____

___________________________________________________________________________

10. Микроорганизм, содержание которого контролируется (род, вид, штамм) ___

___________________________________________________________________________

11. Питательная среда, оптимум роста, время инкубации _____________________

 

Ответственный исполнитель

Руководитель (технологического участка,

лаборатории, подразделения)

 

9.2. Выполнение анализа

 

Агаризованную среду Чапека (сухой бакто-агар Czapek готовят согласно документации фирмы-производителя) или сусло-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °C и разливают в стерильные чашки Петри по 20 куб. см. Чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C на сутки, после чего проросшие чашки бракуют.

После отбора проб воздуха на чашки Петри их помещают в термостат при температуре 32 °C на 48 ч, по истечении которых производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. Микроскопирование культуры проводят с помощью микроскопа биологического с иммерсионной системой типа МБИ-15 в следующих условиях: объектив - планапохроматический; увеличение - 40,0 x 0,65; система - сухая; поле зрения с окуляром 10x в плоскости объекта 1,14 мм; рекомендуемый окуляр - К-6,3x.

 

10. Вычисление результатов измерения

 

Расчет концентрации микробных клеток Aspergillus niger ВКПМ F-171 в 1 куб. м воздуха выполняют на основании 5 проб, полученных при разном времени аспирации (через 2, 4, 6, 8 и 10 мин.) в каждой точке контроля, и производят по формуле:

 

                                   П x 1000

                               K = --------,

                                    C x t

 

где:

K - концентрация клеток продуцента в воздухе, кл./куб. м;

П - количество колоний продуцента, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета 1 куб. дм в 1 куб. м воздуха;

C - скорость аспирации, куб. дм/мин.;

t - время аспирации, мин.

 

11. Оформление результатов измерений

 

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

 

                                Протокол N

       количественного микробиологического анализа штамма-продуцента

            Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны

 

1. Дата проведения анализа ________________________________________________

2. Место отбора пробы _____________________________________________________

3. Название лаборатории ___________________________________________________

4. Юридический адрес организации __________________________________________

 

Результаты микробиологического анализа

 

  Шифр или N пробы 

Определяемый микроорганизм

Концентрация, кл./куб. м

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ответственный исполнитель __________________________________

 

Список литературы

 

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны". М.: Стандартинформ, 1988. 49 с.

2. ГОСТ Р 8.563-96 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений". М.: Госстандарт России, 1997. 19 с.

3. Р 2.2.2006-05 "Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда". М.: Госстандарт России, 2005. 40 с.

4. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

5. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.

6. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитных болезней". М.: Минздрав России, 2008. 19 с.

7. ИК 01-00334557-97 "Инструкция по биологическому и химическому контролю производства пищевой лимонной кислоты". СПб.: ВНИИПАКК, 1997. 268 с.

 

 



Мегабиблиотека по охране труда и технике безопасности. // Некоммерческий проект для инженеров по охране труда. //

Рейтинг@Mail.ru Яндекс цитирования

Copyright © www.УЦОТ.рф, 2012 - 2017