Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в
сфере
защиты прав
потребителей
и благополучия
человека,
Главный
государственный
санитарный врач
Российской
Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
9 июля 2010 года
Дата введения -
с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ
КЛЕТОК
ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ASPERGILLUS NIGER
ВКПМ F-171 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ
ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2656-10
1. Разработаны Государственным образовательным учреждением высшего
профессионального образования "Санкт-Петербургская государственная
медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по
здравоохранению и социальному развитию", Государственным учреждением
Всероссийским научно-исследовательским институтом пищевых ароматизаторов,
кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук (ГУ ВНИИПАКК
РАСХН).
2. Рекомендованы
Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при
Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека.
3. Утверждены
Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и
благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской
Федерации Г.Г. Онищенко 9 июля 2010 г.
4. Введены в
действие с момента утверждения.
5. Введены впервые.
1. Общие
положения и область применения
Настоящие
методические указания устанавливают методику проведения
микробиологического количественного анализа концентрации клеток
штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171,
селекционированного в ГУ ВНИИ пищевых ароматизаторов, кислот и красителей РАСХН
(ГУ ВНИИПАКК), в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000
клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические
указания разработаны с целью обеспечения микробиологического
контроля концентрации конидий штамма Aspergillus niger ВКПМ F-171 в
воздухе производственных помещений биотехнологического производства лимонной
кислоты и оценки соответствия уровня их содержания гигиеническим нормативам на
основе учета требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие
санитарно-гигиенические требования", ГОСТ Р
8.563-96 "Методики выполнения измерений" и Р 2.2.2006-05
"Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового
процесса. Критерии и классификация условий труда".
Методические
указания предназначены для применения в лабораториях организаций,
аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических
исследований.
2.
Биологическая характеристика штамма-продуцента
Aspergillus niger
ВКПМ F-171 и его гигиенический норматив
Продуцент лимонной
кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 относится к микромицетам. Уже на 2-е сутки
на поверхности среды Чапека или сусло-агара при температуре 32 °C клетки (кл.)
образуют округлые колонии диаметром 2,0 см с плоским субстратным мицелием,
аспорогенные. На 5-е сутки роста они достигают максимального диаметра в среднем
8,1 см на среде Чапека и 8,6 см - на сусло-агаре. Окраска гигантской колонии
бежевая - на среде Чапека, светло-бежевая - на сусло-агаре. Воздушный мицелий
сильно развит: от поверхности субстратного мицелия вертикально поднимаются
несептированные клетки - конидиеносцы. Минимальная длина конидиеносца 48 мкм,
максимальная - 1265 мкм. Диаметр поперечного сечения конидиеносца - от 9 до 20
мкм. Верхний конец конидиеносца расширяется, образуя вздутие - пузырек
диаметром от 20 до 60 мкм. От поверхности пузырька синхронно образуются
цилиндрические выросты - стеригмы двуслойной структуры. От каждой стеригмы
первого слоя отделяются, в основном, две вторичные стеригмы. Стеригмы первого
слоя вдвое крупнее, чем стеригмы второго слоя. Длина стеригм первого слоя - от
6 до 32 мкм, второго слоя - от 5 до 10 мкм. Стеригмы второго слоя образуют
цепочки конидий, созревание которых начинается на вторые сутки. Конидии имеют
шарообразную форму, диаметр - 4,1 мкм, толстую пигментированную оболочку с шипами.
Вздутие конидиеносца, стеригмы и конидии являются составляющими конидиальной
головки, диаметр сечения которой колеблется от 44 до 132 мкм. В центре колонии
конидиальные головки расположены плотно. От центра к краю колонии конидиальные
головки мельче. По краю колонии в радиусе 0,5 см - на среде Чапека и 0,6 см -
на сусло-агаре наблюдается светлая зона с незрелыми белыми конидиальными
головками, плотно прижатыми к субстратному мицелию. Обратная сторона колонии
гладкая, белая.
Систематическое
положение микроорганизма
Царство Fungi
Подцарство Neomycota
Отдел
Ascomycota
Подотдел Euascomycotina
Класс
Plectomycetes
Порядок
Hyphomycetales
Род
Aspergillus
Вид Niger
Штамм ВКПМ
F-171, ГУ ВНИИПАКК
Штамм Aspergillus
niger ВКПМ F-171 получен в ГУ ВНИИПАКК методом мутагенеза из штамма Aspergillus
niger Л-1 с использованием химических мутагенов и УФ-облучения
в сочетании с отбором спонтанных вариантов и депонирован в ВКПМ как продуцент
лимонной кислоты.
Штамм растет на
жидких агаризованных средах. Оптимальная температура - от 28 до 32 °C. Для
размножения используется сусло-агар (значение Баллинга 7°).
Предельно допустимая концентрация
Aspergillus niger ВКПМ
F-171 в
3
воздухе рабочей зоны - 1 x 10 кл./куб. м, пометка А,
класс опасности 3.
3. Пределы
измерений
Методика позволяет
выполнить измерения количества клеток продуцента лимонной кислоты в воздухе
рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м.
4. Метод
измерений
Метод измерения
концентрации конидий штамма-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 основан на
аспирации из воздуха конидий микромицета на поверхность среды Чапека или
сусло-агар, подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим
признакам на 2-е сутки роста и контроля их развития на 5-е сутки роста.
5. Средства
измерений, вспомогательные устройства, реактивы
При выполнении
измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и
материалы.
5.1.
Средства измерений, вспомогательные устройства
Импактор
воздуха микробиологический
"Флора-100"
ТУ 64-098-33-95
Термостаты
электрические
суховоздушные типа ТС ТУ
64-1-1382-76
Автоклав
электрический
Бокс,
оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник
бытовой
ГОСТ 16317-87
Весы
лабораторные аналитические ВЛА-200-М
Чашки
Петри бактериологические
плоскодонные,
стеклянные,
диаметром
100 мм ГОСТ 25336-82
Колбы
конические
ГОСТ 25336-82
Микроскоп
биологический с иммерсионной
системой
типа МБИ-15 ГОСТ
25706-83
Термометр
Прибор
для определения влажности воздуха
5.2.
Реактивы, растворы
Среда
Чапека
(или
сухой бакто-агар Czapek)
ТУ 9229-014-00419789-95
(или импортного производства)
Среда
сусло-агар с массовой концентрацией
лимонной
кислоты 1,0% ГОСТ
10444.1-84
Спирт
этиловый ректификованный
из
пищевого сырья
ГОСТ Р 51652-2000
6.
Требования безопасности
При выполнении
измерений концентрации конидий продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 в
воздухе рабочей зоны соблюдают:
- правила техники
безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ
12.1.005-88;
- правила
электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ
12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов;
- требования,
изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике
безопасности в микробиологической промышленности" (1980);
- положения
инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе
в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности
(1977);
- санитарные
правила по работе с микроорганизмами СП 1.3.2322-08;
- требования
безопасности при работе с продуцентом лимонной кислоты, изложенные в инструкции
по контролю производства лимонной кислоты (1997).
Все виды работ с
реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с
биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными
лампами.
7.
Требования к квалификации операторов
К выполнению
измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним
специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки
работы в области микробиологических исследований.
8. Условия
измерений
Измерение
концентрации конидий штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ
F-171 в воздухе рабочей зоны проводят с помощью прибора "Фора-100"
при температуре окружающей среды от 0 до 50 °C и относительной влажности воздуха
не более 80%.
9.
Проведение измерения
9.1.
Условия отбора проб воздуха
Определение
концентрации конидий микромицета Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе
производственных помещений проводят в результате их аспирации на плотную
питательную среду Чапека или сусло-агар с последующей инкубацией в термостате и
подсчетом выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
Воздух аспирируют с
помощью импактора "Флора-100" в автоматическом
режиме со
скоростью 10 куб.
дм/мин. на поверхность
среды Чапека или
сусло-агара
на чашки Петри.
Линейная скорость анализируемого воздуха
автоматически
поддерживается на уровне,
позволяющем осаждать с 50%
эффективностью
частицы диаметром не
менее 1,4 мкм (D ). Контроль
50
параметров
(заданный отбираемый объем воздуха, текущий отобранный объем)
осуществляется методом индикации.
Аспирацию воздуха
проводят с интервалом 2 мин. и отбирают по 5 проб (через 2, 4, 6, 8 и 10 мин.)
в каждой точке контроля. Выбор точек контроля определяется в соответствии с МУК
4.2.734-99.
Отбор проб
сопровождается составлением акта отбора с указанием места, времени и условий
отбора по форме:
Акт
отбора проб
1. Дата, Ф.И.О. работающего
(рабочее место) _______________________________
2. Профессия
______________________________________________________________
3. Предприятие (лаборатория, подразделение)
_______________________________
4. Участок (технологическая стадия, операция)
_____________________________
5. Место отбора (наименование рабочей зоны)
_______________________________
6. Прибор для отбора проб
_________________________________________________
7. Количество проб и точка их отбора
______________________________________
8. Условия отбора проб (объем прокаченного воздуха и
время аспирации) _____
___________________________________________________________________________
9. Дата последней метрологической поверки
оборудования для отбора проб ____
___________________________________________________________________________
10. Микроорганизм, содержание которого
контролируется (род, вид, штамм) ___
___________________________________________________________________________
11. Питательная среда, оптимум роста, время
инкубации _____________________
Ответственный исполнитель
Руководитель (технологического
участка,
лаборатории, подразделения)
9.2.
Выполнение анализа
Агаризованную среду
Чапека (сухой бакто-агар Czapek готовят согласно документации
фирмы-производителя) или сусло-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °C и
разливают в стерильные чашки Петри по 20 куб. см. Чашки с застывшей средой
помещают в термостат при температуре 37 °C на сутки, после чего проросшие чашки
бракуют.
После отбора проб
воздуха на чашки Петри их помещают в термостат при температуре 32 °C на 48 ч,
по истечении которых производят подсчет выросших типичных колоний продуцента.
Микроскопирование культуры проводят с помощью микроскопа биологического с
иммерсионной системой типа МБИ-15 в следующих условиях: объектив -
планапохроматический; увеличение - 40,0 x 0,65; система - сухая; поле зрения с
окуляром 10x в плоскости объекта 1,14 мм; рекомендуемый окуляр - К-6,3x.
10.
Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации
микробных клеток Aspergillus niger ВКПМ F-171 в 1 куб. м воздуха выполняют на
основании 5 проб, полученных при разном времени аспирации (через 2, 4, 6, 8 и
10 мин.) в каждой точке контроля, и производят по формуле:
П x 1000
K = --------,
C x t
где:
K - концентрация
клеток продуцента в воздухе, кл./куб. м;
П - количество колоний продуцента, выросших на чашке Петри;
1000 - коэффициент
пересчета 1 куб. дм в 1 куб. м воздуха;
C - скорость
аспирации, куб. дм/мин.;
t - время
аспирации, мин.
11.
Оформление результатов измерений
Результаты
измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N
количественного микробиологического анализа штамма-продуцента
Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны
1. Дата проведения анализа
________________________________________________
2. Место отбора пробы
_____________________________________________________
3. Название лаборатории
___________________________________________________
4. Юридический адрес организации
__________________________________________
Результаты
микробиологического анализа
|
Шифр или N пробы
|
Определяемый
микроорганизм
|
Концентрация,
кл./куб. м
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Ответственный
исполнитель __________________________________
Список
литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88
"ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей
зоны". М.: Стандартинформ, 1988. 49 с.
2. ГОСТ Р 8.563-96 "Государственная система обеспечения
единства измерений. Методики выполнения измерений". М.: Госстандарт
России, 1997. 19 с.
3. Р 2.2.2006-05 "Руководство по гигиенической оценке
факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий
труда". М.: Госстандарт России, 2005. 40 с.
4. Положение об
организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности.
М., 1980. 27 с.
5. Инструкции по
устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в
микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности.
М., 1977. 7 с.
6. СП 1.3.2322-08
"Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности
(опасности) и возбудителями паразитных болезней". М.: Минздрав России,
2008. 19 с.
7. ИК
01-00334557-97 "Инструкция по биологическому и химическому контролю
производства пищевой лимонной кислоты". СПб.: ВНИИПАКК,
1997. 268 с.