Оставьте ссылку на эту страницу в соцсетях:

Поиск по базе документов:

 

Утверждаю

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации -

Первый заместитель

Министра здравоохранения

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

21 декабря 2000 года

 

Дата введения:

с момента утверждения

 

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.

 

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ

КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМА PSEUDOMONAS

FLUORESCENS (DENITRIFICANS) В 99 - ПРОДУЦЕНТА

ВИТАМИНА В12 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.2.1008-00

 

1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской Л.В. (Государственный научный центр по антибиотикам).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 21 декабря 2000 г.

3. Введены впервые.

 

1. Общие положения и область применения

 

    Настоящие   методические   указания   устанавливают   методику

проведения     микробиологического     количественного     анализа

концентрации клеток штамма Pseudomonas fluorescens (denitrificans)

В  99 - продуцента витамина В   в воздухе рабочей зоны в диапазоне

                             12

концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТа Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".

 

        2. Характеристика штамма - продуцента витамина В

                                                        12

 

    Микроорганизм  Pseudomonas  fluorescens  (denitrificans)  В 99

является  продуцентом витамина  В  . Штамм растет на агаризованных

                                 12

средах  на  основе  мелассы  при  температуре 28 °С. В течение 3-х

суток   образует   округлые   колонии  1  -  2  мм  белого  цвета.

Морфологически   представляет  собой  грамотрицательные  подвижные

палочки размером 0,45 - 0,85 х 0,6 мкм. Штамм устойчив к следующим

антибиотикам:    левомицетину,    линкомицину,    полимиксину   М,

ристомицину, цефалотину и эритромицину.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл./куб. м.

 

3. Пределы измерений

 

    Методика  обеспечивает  выполнения измерений количества клеток

продуцента  витамина  В    в  воздухе  рабочей  зоны  в  диапазоне

                       12

концентраций  от  100  до  3000  клеток  в  1  куб.  м воздуха при

доверительной вероятности 0,95.

 

4. Метод измерений

 

    Метод  основан  на  аспирации  из  воздуха  клеток  продуцента

витамина В   и на поверхность плотной питательной среды и подсчете

          12

выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

 

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,

реактивы и материалы

 

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

 

5.1. Средства измерений, вспомогательные

устройства, материалы

 

Прибор для бактериологического анализа воздуха,     ТУ 64-12791-77

модель 818 (щелевой прибор Кротова)

Термостаты электрические суховоздушные

или водяные

Автоклав электрический                              ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной

системой типа "Биолам" Л-211

Лупа с увеличением х 10                             ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные

стеклянные диаметром 100 мм

Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл      ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                      ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                      ГОСТ 1770-74

Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл          ГОСТ 1770-74

Секундомер                                          ГОСТ 9586-75

Барометр                                            ГОСТ 24696-79

Марля медицинская                                   ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая                   ГОСТ 25556-81.

 

5.2. Реактивы, растворы

 

Антибиотики: левомицетин, линкомицин, полимиксин М, цефалотин, эритромицин.

 

    Спирт этиловый ректификат                         ГОСТ 5962-67

    Селективная среда для штамма-продуцента.

 

    Среда: меласса - 100 - 150 г; (NH ) HPO  - 1,3 г; MgSO 7H O  -

                                     4 2   4              4  2

1,0 г; (NH ) SO  - 0,5 г; MnSO H O - 0,1 г; ZnSO 7H O  -  0,1   г;

          4 2  4              4 2               4  2

агар Difco - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл;  рН - 6,8 -

7,0; стерилизация - 121 °С, 30 минут.

 

6. Требования безопасности

 

    При   выполнении   измерений  концентрации  клеток  продуцента

витамина   В     в   воздухе   рабочей  зоны  соблюдают  следующие

            12

требования.

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. Руководство "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980), "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

 

7. Требования к квалификации операторов

 

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

 

8. Условия измерений

 

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха 20 +/- 5 °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

 

9. Проведение измерения

 

9.1. Условия отбора проб воздуха

 

    Для  определения продуцента витамина В   воздух аспирируют при

                                          12

помощи  аппарата  Кротова  со  скоростью  10 л/мин. на поверхность

плотной  питательной  среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин.)

зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

 

9.2. Выполнение анализа

 

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2 - 3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (левомицетин, линкомицин, цефалотин и др.) из расчета 30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при 28 °С. Через 48 - 72 часа производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

 

10. Вычисление результатов измерения

 

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

 

                           N 1000

                       Х = ------, кл./куб. м,

                              V

 

где:

Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 минут (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе). При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин. - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм (радиус 8 см) равна 78,54 кв. см.

Составляем пропорцию:

на 100 кв. см за 1 мин. оседает 2 л воздуха

на 78,54 кв. см - Х л

Х = 1,57 л/мин.

Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин. оседает 1,57 л воздуха.

Надо определить количество клеток в 1 куб. м воздуха.

На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин. оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин. - 1,57 х Тл.

В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 куб. м воздуха содержится:

 

                       N х 1000   N х 636,9

                       -------- = ---------.

                       1,57 х Т       Т

 

    Пример:   за   30   мин.   седиментации   выросло  12  колоний

микроорганизма. В 1 куб. м воздуха содержится:

 

                     12 х 636,9

                     ---------- = 253 клетки.

                         30

 

11. Оформление результатов измерений

 

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

 

                            Протокол N

           Количественного микробиологического анализа

           штамма - продуцента Pseudomonas fluorescens

           (denitrificans) В 99 в воздухе рабочей зоны

 

    Дата проведения анализа ______________________________________

    Место отбора пробы ___________________________________________

    Название лаборатории _________________________________________

    Юридический адрес организации ________________________________

 

              Результаты микробиологического анализа

 

Шифр или N пробы

     Определяемый     
     микроорганизм    

Концентрация, кл/куб. м

 

 

 

 

    Ответственный исполнитель

    Научный руководитель

 

Список литературы

 

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".

2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности, М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности, М., 1977. 7 с.

 

 



Мегабиблиотека по охране труда и технике безопасности. // Некоммерческий проект для инженеров по охране труда. //

Рейтинг@Mail.ru Яндекс цитирования

Copyright © www.УЦОТ.рф, 2012 - 2018