Утверждаю
Главный
государственный
санитарный врач
Российской
Федерации,
Первый заместитель
Министра
здравоохранения
Российской
Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
20 сентября 2001
года
Дата введения:
с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ
КЛЕТОК ПЛЕСНЕВОГО ГРИБА PENICILLIUM FUNICULOSUM
F-149 - ПРОДУЦЕНТА ДЕКСТРАНАЗЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1069-01
1. Разработаны д.м.н. Ивановым Н.Г., к.б.н. Шеиной Н.И.
(Российский государственный медицинский университет).
2. Утверждены и
введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской
Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации
20 сентября 2001 г.
3. Введены впервые.
1. Общие
положения и область применения
Настоящие
методические указания устанавливают методику проведения
микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма
Penicillium funiculosum F-149 - продуцента декстраназы в воздухе рабочей зоны в
диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические
указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ.
Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".
Методические
указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и
учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
2.
Биологическая характеристика плесневого гриба
Penicillium
funiculosum F-149 и его гигиенический норматив
Систематическое
положение микроорганизма
Класс Fungi imperfecti
Порядок Hyphomycetales
Семейство
Mucedinaceae
Род Penicillium
Секция Biverticillata
Вид funiculosum
Штамм F-149
Округлые колонии
имеют 4 - 5 мм в диаметре, в зависимости от плотности посева могут достигать 11
мм в диаметре. Поверхность колоний слабошероховатая, пушистая, консистенция
мягкая. Воздушный мицелий имеет белоснежно-белую окраску. На 3 - 4 день
развития желтовато-кремовый субстрат меняет свою окраску, становясь ярко-оранжевым.
Продолжительность развития гриба составляет 26 - 30 дней. Репродуктивными
органами гриба являются конидиеносцы с конидиями (споры), может также
размножаться вегетативно (фрагментами мицелия).
Штамм Penicillium
funiculosum F-149 получен из Всероссийской коллекции промышленных
микроорганизмов ГНИИгенетики. Штамм является продуцентом декстраназы.
Активность по методу Нельсона составляет 10 - 12 ед./мл культуральной жидкости.
Изучаемый штамм выделен из почвы, аэроб, растет на жидких и агаризованных
средах. Оптимальная температура роста 28 - 30 °С,
оптимальный рН 6 - 8. Наиболее интенсивный рост наблюдается на агаризованном
пивном сусле 7 °Б, для выращивания могут также
использоваться картофельно-сахарозный агар, агаризованная среда Чапека, среда Чапека
- Докса.
Предельно
допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл./куб. м, пометка
А.
3. Пределы
измерений
Методика
обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в воздухе
рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха
при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод
измерений
Метод основан на
аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной
среды и подсчете выросших колоний по типичным морфологическим признакам и
ярко-оранжевому окрашиванию субстрата на 3 - 4 сутки. Вопрос о корреляции между
пигментной и ферментативной активностью плесневого гриба требует дополнительных
исследований.
5. Средства
измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы
При выполнении
измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и
материалы.
5.1.
Средства измерений, вспомогательные
устройства,
материалы
Прибор
для бактериологического анализа
воздуха,
модель 818
(щелевой
прибор Кротова)
ТУ 64-12791-77
Термостаты
электрические суховоздушные
или
водяные
Автоклав
электрический
ГОСТ 9586-75
Бокс,
оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник
бытовой
Весы
лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп
биологический с иммерсионной
системой
типа "Биолам" Л-211
Лупа
с увеличением х10
ГОСТ 25706-83
Чашки
Петри бактериологические плоскодонные
стеклянные
диаметром 100 мм
Пробирки
биологические вместимостью 20 и 35 мл
ГОСТ 10515-75
Пипетки
мерные на 1, 5 и 10 мл
ГОСТ 10515-75
Пипетки
мерные на 1, 5 и 10 мл
ГОСТ 1770-74
Колбы
конические вместимостью 250 и 500 мл
ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ
9586-75
Барометр
ГОСТ 24696-79
Марля
медицинская
ГОСТ 9412-77
Вата
медицинская гигроскопическая
ГОСТ 25556-81.
5.2.
Реактивы, растворы
Антибиотики
группы аминогликозидов: канамицин,
неомицин
и др.
Спирт
этиловый ректификат
ГОСТ 5962-67
Агаризованное
пивное сусло 7 °Б для штамма-
продуцента (агар - 1,8%, рН 6,8, режим
стерилизации
1,1 - 1,2 атм. в течение 30 мин.).
6.
Требования безопасности
При выполнении
измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны
соблюдают:
- правила техники
безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
- правила электробезопасности
при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по
эксплуатации прибора;
- требования,
изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике
безопасности в микробиологической промышленности" (1980);
- положения
"Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при
работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической
промышленности" (1977).
Все виды работ с
реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с
биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными
лампами.
7.
Требования к квалификации операторов
К выполнению
измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним
специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки
работы в области микробиологических исследований.
8. Условия
измерений
Процессы
приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных
условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности
воздуха не более 80%.
9.
Проведение измерений
9.1.
Условия отбора проб воздуха
Для определения
концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи аппарата
Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды -
пивное агаризованное сусло 7 °Б. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин.) зависит
от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.
Аппарат Кротова
перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно
тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку
прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают
подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор
закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора
пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и
закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают
точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2.
Выполнение анализа
Метод предполагает
учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3 -
4 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200
колоний продуцента.
Агаризованное
пивное сусло 7 °Б расплавляют, остужают до 50 - 60 °С,
добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор
антибиотика (канамицин, неомицин и др.) из расчета 20 - 30 мг на 1 л среды (для
подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и
разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.
Чашки с застывшей
средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С,
после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля
воздуха.
После отбора проб
воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 28 - 30 °С. Через 72 ч
производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости
культуру подвергают микроскопированию.
10.
Вычисление результатов измерений
Расчет концентрации
клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:
N х 1000
Х = --------, кл./куб.
м,
V
где:
Х - концентрация
клеток продуцента в воздухе;
N - количество
колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент
пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
В случае
невозможности использования аппарата Кротова рекомендуем применять метод
седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с
плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 30
мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации
клеток продуцента:
эмпирически
установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см оседает количество бактерий,
содержащееся в 10 л воздуха, следовательно, за 1 мин. - количество бактерий из
2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 кв. см. Составляя
пропорцию, определяем, что за 1 мин. на стеклянную чашку Петри оседают клетки,
содержащиеся в 1,57 л воздуха. Количество клеток в 1 куб. м воздуха определяем
по вышеприведенной формуле, где V = 1,57 л/мин. х t (время аспирации, мин.).
Предлагаемый метод
является ориентировочным и может быть использован как вспомогательный метод.
11.
Оформление результатов измерений
Результаты
измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N _____
количественного
микробиологического анализа
штамма-продуцента
Penicillium funiculosum F-149
в воздухе рабочей
зоны
Дата проведения
анализа ______________________________
Место отбора пробы
___________________________________
Название
лаборатории _________________________________
Юридический адрес
организации ________________________
Результаты
микробиологического анализа
|
Шифр
или N пробы
|
Определяемый
микроорганизм
|
Концентрация,
кл./куб. м
|
|
|
|
|
Ответственный
исполнитель
Научный
руководитель
Список
литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88
"ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования".
2. ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".
3. Положение об
организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности
(М., 1980, 27 с.).
4. Инструкции по
устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в
микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности
(М., 1977, 7 с.).