Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в
сфере
защиты прав
потребителей
и благополучия
человека,
Главный
государственный
санитарный врач
Российской
Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 августа 2007 года
Дата введения:
1 октября 2007 года
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК
ПЛЕСНЕВОГО ГРИБА PENICILLIUM CANESCENS PLPH33 -
ПРОДУЦЕНТА
ПЕКТИНЛИАЗЫ И ФИТАЗЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2234-07
1. Рекомендованы к
утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому
нормированию Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и
благополучия человека (протокол от 29 марта 2007 г. N 1).
2. Утверждены
Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и
благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской
Федерации Г.Г. Онищенко 6 августа 2007 г.
3. Разработаны ГОУ ВПО "Российский государственный
медицинский университет".
4. Введены в
действие с 1 октября 2007 г.
5. Введены впервые.
1. Общие
положения и область применения
Настоящие
методические указания устанавливают методику проведения
микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма
Penicillium canescens PlPh33 - продуцента пектинлиазы и фитазы в воздухе
рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические
указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ.
Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".
Методические
указания предназначены для применения в учреждениях Федеральной службы по
надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в
лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в
установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
Методические
указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты
биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной
комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".
2.
Биологическая характеристика Penicillium canescens
PlPh33 и его
гигиенический норматив
Штамм мицелиального
гриба Penicillium canescens PlPh33 является продуцентом пектинлиазы и фитазы. Получен из штамма Penicillium canescens ВКПМ F-178 путем
селекции. Депонирован во Всероссийской коллекции
микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ F-3867D.
Растет на
агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым
автолизатом, сусло-агар, Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар) при температуре
25 - 28 °C в течение 5 - 7 сут., pH 5,0 - 6,0. При температуре 5 и 37 °C роста
колоний не наблюдается.
На среде Чапека с
дрожжевым автолизатом и сусло-агаре колонии достигают максимального диаметра 5
- 6 см. Колонии радиально складчатые, средней плотности, ростовая зона плотная.
Мицелий белый, конидиальная зона голубовато-серебристая, конидиогенез обильный.
Обратная сторона палевая, буроватая, со временем темно-коричневая.
При
микроскопическом исследовании конидиеносцы двухъярусные, терминальные,
фуркатные, шероховатые, длиной 150 мкм, шириной 3 - 4 мкм. Метулы шероховатые,
размером 10 - 18 x 2,5 - 3,5 мкм, фиалиды ампулиформные, размером 7 - 8 x 2 - 3
мкм, конидии чаще округлые, гладкие, размером 2,2 - 3,0 x 2,0 - 3,0 мкм.
Предельно
допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл./куб. м, пометка
А.
3. Пределы
измерений
Методика
обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в воздухе
рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха
при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод
измерений
Метод основан на
аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность агаризованной среды
и подсчете выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и
физиолого-биохимическим признакам на 3-и сут.
5. Средства
измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и
материалы
При выполнении
измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и
материалы.
5.1.
Средства измерений, вспомогательные
устройства,
материалы
Импактор
микробиологический "Флора-100" ТУ 9443-001-05031637-2002
Прибор
для бактериологического анализа воздуха,
модель
818 (щелевой прибор Кротова)
ТУ 64-12791-77
Прибор
MAS - 100 ECO фирмы Merk (Германия)
для
отбора проб воздуха
Термостаты
электрические суховоздушные
или
водяные
Автоклав
электрический ГОСТ 9586-75
Бокс,
оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник
бытовой
Ареометр-сахарометр
с диапазоном измерений
0
- 10% с ценой деления 0,1%
ГОСТ 18481-87
Весы
лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп
биологический с иммерсионной
системой
типа "Биолам" Л-211
Лупа
с увеличением 10x
ГОСТ 25706-83
Чашки
Петри бактериологические плоскодонные
стеклянные,
диаметром 90 мм
ГОСТ 23932-90
Пробирки
бактериологические П1 и П2
вместимостью
15 и 20 мл ГОСТ
25336-82
Пипетки
мерные на 1, 5 и 10 мл
ГОСТ 10515-75
Пипетки
мерные на 1, 5 и 10 мл
ГОСТ 1770-74
Колбы
конические вместимостью 250 и 500 мл
ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ
9586-75
Барометр ГОСТ
24696-79
Марля
медицинская
ГОСТ 9412-77
Вата
медицинская гигроскопическая
ГОСТ 25556-81
5.2.
Реактивы, растворы
Агар
микробиологический
ГОСТ 17206-84
Экстракт
солодовый
ГОСТ 418-84
Пектин ГОСТ Р
51806-2001
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
Спирт
этиловый ректификат
ГОСТ 5962-67
Кислота молочная пищевая (для подкисления
среды
и подавления посторонней
бактериальной
флоры) ГОСТ 490-79
Среда сусло-агар:
солодовое сусло 7° Б - 98%, агар-агар - 2%, pH среды -
4,5 - 5,0, режим стерилизации: Р - 0,8 кгс/кв. см, 40 мин. Для приготовления
солодового сусла 7° Б солодовый экстракт растворяют в
дистиллированной воде до 7% содержания сахара с помощью ареометра.
6.
Требования безопасности
При выполнении
измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны
соблюдают требования:
- санитарных правил
СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп
патогенности и гельминтами";
- правил техники
безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
- правил
электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и
инструкции по эксплуатации прибора;
- руководства
"Положение об организации работы по технике безопасности в
микробиологической промышленности" (1980);
- "Инструкции
по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в
микробиологических лабораториях предприятий микробиологической
промышленности" (1977).
Все виды работ с
реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с
биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными
лампами.
7.
Требования к квалификации операторов
К выполнению
измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним
специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки
работы в области микробиологических исследований.
8. Условия
измерений
Процессы
приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных
условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферном давлении 630 - 800
мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.
9.
Проведение измерения
9.1.
Условия отбора проб воздуха
Для определения
концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи
пробоотборника со скоростью 10 л/мин. на поверхность агаризованной среды. Время
аспирации воздуха (1 - 10 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток
штамма-продуцента.
Аппарат перед
каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно
обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную
и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную
чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают.
Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы
воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и
закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают
точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2.
Выполнение анализа
Метод предполагает
учет количества типичных колоний, выросших на 2 - 3-и сут. после посева проб
воздуха по культурально-морфологическим признакам. Прямой метод позволяет
учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Агаризованную среду
сусло-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °C, добавляют молочную кислоту из
расчета 2 мл на 0,5 л среды (для подкисления среды и подавления посторонней
бактериальной микрофлоры, pH 5,0 - 6,0), тщательно перемешивают и разливают по
10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.
Чашки с застывшей
средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего
проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб
воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 28 °C. Через 3 - 4
сут. проводят подсчет выросших типичных по морфологическим признакам колоний
продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
При микробиологическом
анализе воздуха производственных помещений дополнительным функциональным
методом является отбор пробы воздуха на чашки Петри с агаризованной средой.
После отбора проб чашки покрывают слоем 2%-го водного пектина толщиной 0,5 см.
Затем инкубируют в термостате при 28 °C в течение 48 - 72 ч и подсчитывают
количество зон осветления и разложения пектина вокруг выросших колоний.
Ростовые
свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в
соответствии с "Требованиями к ростовым свойствам питательных сред"
(Государственная фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2. С. 208), что позволит более полно оценить пределы
ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается
на 2 - 3 чашки каждой используемой среды.
10.
Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации
клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха проводят по формуле:
N x 1000
X = --------,
V
где:
X - концентрация клеток
продуцента в воздухе, кл./куб. м;
N - количество
колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент
пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
11.
Оформление результатов измерений
Результаты
измерений оформляют протоколом по приведенной форме.
Протокол N ___
количественного
микробиологического анализа
штамма-продуцента
P. canescens PlPh33
в воздухе рабочей
зоны
1. Дата
проведения анализа ____________________________________________
2. Место
отбора пробы _________________________________________________
3.
Название лаборатории _______________________________________________
4.
Юридический адрес организации ______________________________________
Результаты
микробиологического анализа
|
Шифр или N пробы
|
Определяемый
микроорганизм
|
Концентрация, кл./куб. м
|
|
|
|
|
Ответственный
исполнитель:
Научный
руководитель:
Список
литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88
"ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования".
2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".
3. Положение об
организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности.
М., 1980. 27 с.
4. Инструкции по
устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических
лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.
5. Бабьева И.П.,
Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ. С. 122.