Утверждаю

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека,

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

4 августа 2010 года

 

Дата введения -

4 октября 2010 года

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

 

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ

ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА БУТАНОЛА CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM 3108

В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.2.2716-10

 

1. Разработаны ФГУН Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов; ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 4 августа 2010 г.

4. Введены в действие с 4 октября 2010 г.

5. Введены впервые.

 

1. Общие положения и область применения

 

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации штамма-продуцента бутанола Cl. acetobutylicum 3108 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для применения в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в лабораториях других предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".

 

2. Биологическая характеристика штамма

Cl. acetobutylicum 3108 и его гигиенический норматив

 

Систематическое положение микроорганизма.

    Класс                   Schizomycetes

    Отряд                   Eubacteriales

    Семейство               Bacillaceae

    Род                     Clostridium

    Вид                     acetobutylicum

    Штамм                   3108

Штамм Clostridium acetobutylicum 3108 выделен из почвы, строгий анаэроб, представлен грамположительными спорообразующими прямыми палочками. Палочки размером 0,6 - 0,9 x 2,4 - 4,7 мкм подвижны за счет перитрихиальных жгутиков. Образуют центрально расположенные эндоспоры, обычно растягивающие клетку. Обладают сахаролитическими и протеолитическими свойствами. Желатин и глюкозу гидролизуют, ферментируют молоко. Не редуцируют сульфаты. Каталазоотрицательные.

Штамм растет на жидких и агаризованных средах. Оптимальная температура роста 36 - 37 °C. На твердой питательной среде (картофельно-глюкозный агар) на 2 - 3-и сутки роста в анаэростате образует очень мелкие (0,7 - 1,5 мм), светлые, непигментированные, полупрозрачные круглые колонии однородной структуры, блестящие, с выпуклой гладкой поверхностью.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) штамма в воздухе рабочей зоны - 5000 кл./куб. м, пометка А.

 

3. Пределы измерений

 

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток микроорганизма Cl. acetobutylicum 3108 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

 

4. Метод измерений

 

Метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений клеток микроорганизма на плотную картофельно-глюкозную среду, выращивании в анаэростате в течение 2 - 3 суток при температуре 36 - 37 °C и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

 

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,

реактивы и материалы

 

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

 

5.1. Средства измерений, вспомогательные

устройства, материалы

 

Импактор микробиологический "Флора-100"           ТУ 9443-001-05031637-2002

Прибор для бактериологического анализа

воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)      ТУ 64-12791-77

Прибор MAS-100 ECO фирмы "Merk"

(Германия) для отбора проб воздуха <*>

Термостаты электрические                          ГОСТ 10444.12-88

Автоклав электрический                            ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой                               ГОСТ 26678-85

Весы лабораторные ВЛКТ-500                        ГОСТ 24104-88

Микроскоп биологический с иммерсионной

системой типа "Биолам" Л-211

Лупа с увеличением x10                            ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные,

стеклянные, диаметром 90 мм                       ГОСТ 23932-90

Пробирки бактериологические П1 и П2

вместимостью 15 и 20 мл                           ГОСТ 25336-82

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                    ГОСТ 10515-75

Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл        ГОСТ 1770-74

Секундомер                                        ГОСТ 9586-75

Барометр                                          ГОСТ 24696-79

Марля медицинская                                 ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая                 ГОСТ 25556-81

--------------------------------

<*> Возможно также использование других сертифицированных аналогов пробоотборника.

 

5.2. Реактивы, растворы

 

Агар микробиологический                           ГОСТ 17206-84

Вода дистиллированная                             ГОСТ 6709-72

Спирт этиловый ректификат                         ГОСТ 5962-67

Агаризованная картофельно-глюкозная среда

(агар - 20 г/л, очищенный и измельченный

картофель - 250 г/л, глюкоза - 5 г/л,

сульфат аммония - 1,5 г/л, мел - 2,0 г/л,

цистеин - 0,5 г/л), pH 6,2, режим стерилизации:

1 атм., 20 мин.

 

6. Требования безопасности

 

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Санитарные правила СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

6.2. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.3. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.4. Руководство "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980), "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

 

7. Требования к квалификации операторов

 

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

 

8. Условия измерений

 

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

 

9. Проведение измерения

 

9.1. Условия отбора проб воздуха

 

Для определения концентрации клеток микроорганизма воздух аспирируют при помощи пробоотборника со скоростью 100 л/мин. на поверхность плотной питательной картофельно-глюкозной среды. Время аспирации воздуха (1 - 5 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

 

9.2. Выполнение анализа

 

При выполнении анализа воздуха картофельно-глюкозную среду расплавляют, остужают до 50 - 60 °C, тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в анаэростат и термостатируют при температуре 36 - 37 °C. Через 48 - 72 ч производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены в соответствии с "Требованиями к ростовым свойствам питательных сред" (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 - 3 чашки используемой среды, термостатируется в анаэростате и на 2 - 3-и сутки производится подсчет выросших колоний.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать в 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

 

10. Вычисление результатов измерения

 

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

 

                             N x 1000

                         X = --------, кл./куб. м,

                                 V

 

где:

X - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество зон вокруг колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

 

11. Оформление результатов измерений

 

Результаты измерений оформляют протоколом по форме:

 

Протокол N

количественного микробиологического анализа

штамма-продуцента Cl. acetobutylicum

в воздухе рабочей зоны

 

1. Наименование и адрес испытательной лаборатории (центра), проводящей измерения, аттестат аккредитации лаборатории.

2. Юридический и фактический адрес организации-заказчика.

3. Идентификация используемого метода, методики, ссылки на методы, используемые испытательной лабораторией.

4. Описание состояния объекта исследования.

5. Дата получения объекта измерений и дата проведения анализа.

6. Место отбора пробы.

7. Результаты микробиологического анализа

 

Шифр или N пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация, кл./куб. м

 

Ответственный исполнитель:

Научный руководитель:

 

Список литературы

 

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".

2. ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.