"Методы лабораторной специфической диагностики профессиональных аллергических заболеваний химической этиологии. Методические рекомендации" // Мегабиблиотека по охране труда

Утверждаю

Заместитель начальника

Главного лечебно-профилактического

управления МЗ СССР

В.В.ТРЕСКУНОВ

25 декабря 1979 г. N 10-8/94

МЕТОДЫ

ЛАБОРАТОРНОЙ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ПРОФЕССИОНАЛЬНЫХ

АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ХИМИЧЕСКОЙ ЭТИОЛОГИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В настоящих Методических рекомендациях обосновывается целесообразность лабораторной специфической диагностики профессиональных аллергических заболеваний химической этиологии и ранних стадий сенсибилизации к производственным химическим аллергенам, приводятся подробные инструкции по выполнению десяти иммунологических методик с указанием рабочих доз для наиболее распространенных промышленных химических аллергенов.

Методические рекомендации предназначены для врачей медико-санитарных частей, профпатологических и аллергологических отделений больниц, профпатологических и аллергологических клиник научно-исследовательских институтов гигиены труда и профзаболеваний, медицинских институтов усовершенствования врачей.

Методические рекомендации составлены сотрудниками лаборатории промышленной иммунологии и аллергологии Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР.

Проблема профессиональных аллергических заболеваний химической этиологии является актуальной для стран с высокоразвитой химической промышленностью. Наблюдаемый в последние годы рост заболеваемости профессиональными аллергозами органов дыхания и абсолютное превалирование аллергодерматозов в структуре профессиональных заболеваний кожи связано с целым рядом факторов: увеличением числа аллергоопасных предприятий, существенным снижением общетоксического действия ядов, что способствует преимущественному проявлению их специфического, в том числе аллергенного, действия, увеличением общей аллергизации населения развитых стран, существенным улучшением диагностики аллергических заболеваний и т.д.

В связи с тем, что профессиональные аллергические заболевания химической этиологии заняли за последнее время значительное место в клинике профессиональной патологии, крайне актуальными стали вопросы их диагностики, имеющие не только медицинское, но и большое социальное значение. Установление этиологического фактора аллергического заболевания представляет определенные трудности, так как современная промышленность характеризуется многофакторностью производственной среды и возможностью воздействия на рабочих целого ряда химических аллергенов при различных путях их поступления в организм. До настоящего времени сложными остаются вопросы дифференциальной диагностики профессиональных аллергических заболеваний, осложненных инфекционным аллергическим процессом. В последние годы исключительное внимание уделяется ранней диагностике сенсибилизации к промышленным химическим аллергенам, что является одним из важных направлений профилактики профессиональных аллергических заболеваний.

Решению вопросов диагностики профессиональных аллергозов химической этиологии в значительной степени помогают данные профессионального маршрута, позволяющие выяснить наличие контакта больного со всеми соответствующими производственными аллергенами, сбор и анализ аллергологического анамнеза и весь комплекс клинико-аллергологического обследования, включая методы специфической диагностики с подозреваемыми производственными аллергенами.

Однако, несмотря на безусловную диагностическую ценность различных провокационных проб (ингаляционных, эндоназальных, кожных и т.д.), их проведение с промышленными химическими аллергенами представляет определенную опасность, особенно для высокосенсибилизированных лиц, и довольно часто ограничивается клиническими противопоказаниями. Кроме того, провокационные пробы возможны далеко не со всеми химическими аллергенами из-за их токсичности или выраженного раздражающего действия, а подбор тест-дозы, который проводится на здоровых лицах, интактных по отношению к данному аллергену, является сложным и для многих аллергенов еще не осуществлен.

В отличие от провокационных проб, абсолютно безопасными для обследуемых лиц, и в то же время специфичными и чувствительными являются методы лабораторной специфической диагностики - различные иммунологические тесты с химическими аллергенами, подбор рабочих доз для которых осуществляют in vitro. Методы лабораторной специфической диагностики позволяют проводить многократное обследование больных, т.е. в динамике заболевания, а для выяснения этиологического фактора - параллельно со всеми производственными аллергенами.

В настоящее время разработан и апробирован значительный круг методов лабораторной специфической диагностики, которые позволяют оценить различные стороны и механизмы иммунного ответа на воздействие химических аллергенов <1>:

- реакции клеток крови на гаптен in vitro как клеток-мишеней для образующегося иммунного комплекса (специфическая агломерация лейкоцитов, повреждение и альтерация нейтрофилов, специфический лизис лейкоцитов, прямое специфическое повреждение базофилов);

- серологические реакции для выявления циркулирующих в крови гуморальных антигаптенных антител (специфическая микропреципитация в жидкой среде, связывание комплемента, пассивная гемагглютинация, непрямой базофильный тест);

- клеточные реакции гиперчувствительности in vitro (торможение прилипания клеток, специфическое розеткообразование, торможение миграции лейкоцитов, специфическая бласттрансформация лимфоцитов).

--------------------------------

<1> В последующее описание методик не включены сложные по выполнению непрямой базофильный тест и реакция специфической бласттрансформации лимфоцитов крови.

Для целей специфической диагностики профессиональных аллергозов и, в частности, для выявления этиологического фактора, когда довольно часто возникает необходимость проведения параллельных исследований со всеми производственными аллергенами, целесообразно использовать технически наиболее простые реакции клеток крови на гаптен in vitro, клеточные и серологические реакции: специфической агломерации или лизиса лейкоцитов (РСАЛ или РСЛЛ), альтерации нейтрофилов, упрощенный вариант реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), специфической микропреципитации в жидкой среде (РСМП). Такой иммунологический тест, как повреждение нейтрофилов крови (ППН), может быть использован только при ограниченном числе исследуемых аллергенов, поскольку проведение этой реакции связано с гистохимической окраской клеток крови. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), требующая определенной иммунологической компетенции, и особенно при приготовлении эритроцитарных диагностикумов с химическими детерминантами, целесообразно ставить только с водонерастворимыми химическими аллергенами, с которыми невозможно проведение клеточных или других серологических реакций.

Для оценки тяжести профессиональных аллергических заболеваний органов дыхания наиболее информативными являются тесты, позволяющие оценить реакцию на специфический аллерген таких клеток-мишеней, как базофилы (в реакции прямого специфического повреждения базофилов крови - РСПБ), а также определить титр повреждающих циркулирующих антигаптенных антител (в реакции связывания комплемента - РСК). При аллергических заболеваниях, протекающих преимущественно по замедленному типу гиперчувствительности, и в частности при профессиональных аллергодерматозах, целесообразна постановка реакции торможения миграции лейкоцитов - РТМЛ, которая является аналогом ГЗТ in vitro. Для выявления патогенетической роли сенсибилизации к химическим аллергенам, и особенно при осложненных инфекционно-аллергических формах поражения, существенную помощь может оказать такой методический прием, как постановка иммунологических реакций до и после (через 24 - 48 часов) проведения провокационных тестов с соответствующим химическим аллергеном (кожных, ингаляционных, эндоназальных). При этом увеличение титра антигаптенных антител и усиление реакций клеток крови на гаптен может иметь место у больных профессиональными аллергозами не только с положительным, но и с сомнительным и отрицательным эффектом провокационной пробы. Клеточные реакции гиперчувствительности in vitro (торможения прилипания клеток - РТПК, специфического розеткообразования - РОК) позволяют оценить различные популяции иммунокомпетентных клеток и их значение в патогенезе профессиональных аллергозов химической этиологии. Иммунологическое обследование больных профессиональными аллергозами в динамике заболевания дает возможность определить эффективность лечебных мероприятий и прогнозировать дальнейшее течение специфического аллергического процесса.

Для диагностики ранних стадий сенсибилизации целесообразно использовать технически наиболее простые методы специфической аллергодиагностики in vitro - реакции специфической агломерации, лизиса лейкоцитов (РСАЛ, РСЛЛ), альтерации нейтрофилов, упрощенного варианта реакции торможения лейкоцитов (РТМЛ), микропреципитации в жидкой среде (РСМП), которые могут быть включены в практику медицинских осмотров рабочих аллергоопасных предприятий. Для оценки преморбидных аллергических состояний и ранних стадий аллергического заболевания определенное значение могут иметь иммунологические тесты, свидетельствующие о наличии в крови специфических иммуноглобулинов класса Е (по РСПБ), повреждающих комплементсвязывающих антигаптенных антител (в РСК) и продукции лимфокинов (в РТМЛ). Своевременная диагностика аллергического процесса, обусловленного воздействием производственных химических аллергенов, может способствовать профилактике развития более тяжелых, а впоследствии осложненных форм профессиональных аллергических заболеваний.

Вопросы специфической иммунодиагностики профессиональных аллергозов и ранних стадий сенсибилизации к производственным химическим аллергенам могут быть решены уже в медико-санитарной части промышленного предприятия, в профпатологических и аллергологических кабинетах путем постановки технически наиболее простых специфических иммунологических тестов (РСАЛ, РСЛЛ, РСМП, теста альтерации нейтрофилов, упрощенного варианта РТМЛ), выполнимых лаборантом клинико-диагностических лабораторий. Клинико-иммунологическое обследование больных лиц с использованием более сложных иммунологических методик целесообразно проводить в лабораториях специализированных профпатологических и аллергологических отделений и клиник.

В настоящих Методических рекомендациях представлены принципы использования химических аллергенов в диагностических реакциях in vitro и инструкции по выполнению десяти иммунологических лабораторных тестов.

ПРИНЦИПЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ХИМИЧЕСКИХ АЛЛЕРГЕНОВ

В ДИАГНОСТИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ in vitro

Особенности промышленных химических аллергенов (сложный состав и водонерастворимость многих из них, выраженные токсические и раздражающие свойства и т.д.) определяют необходимость соблюдения ряда условий при постановке с ними иммунологических реакций для исключения их цитотоксического или денатурирующего действия на клетки или сыворотку крови:

- использование в реакциях in vitro водорастворимых химических аллергенов, а для нерастворимых в воде - замена их водорастворимыми аналогами с соответствующими химическими детерминантами;

- выбор специфических групповых гаптенов для сложных химических композиций и полимерных материалов, которыми могут служить их отдельные водорастворимые аллергенные ингредиенты, в том числе мономеры;

- подбор и проверка рабочих доз химических аллергенов для иммунологических реакций с клетками или с сывороткой крови здоровых лиц и больных аллергозами другой химической этиологии, не имевших контакта с данным аллергеном (так называемый интактный контроль и контроль на специфичность).

Целесообразность использования водорастворимых химических аллергенов связана с тем, что введение во многие иммунологические реакции различных растворителей создает дополнительную опасность развития неспецифических, и в первую очередь цитотоксических реакций, и существенно затрудняет подбор рабочей дозы водонерастворимого химического аллергена. Использование растворителей для водонерастворимых химических аллергенов (обычно ацетона) ограничивается реакцией пассивной гемагглютинации на этапе приготовления эритроцитарных диагностикумов с химическими детерминантами.

При выборе специфического гаптена для иммунологических реакций необходимо иметь в виду, что некоторые химические соединения, которые в целом расцениваются как водонерастворимые, все же способны растворяться в воде в малых количествах (например, эпихлоргидрин, некоторые диизоцианаты и т.д.), и эти дозы могут быть достаточными по антигенности. При необходимости диагностировать сенсибилизацию или аллергическое заболевание, связанное с воздействием отвержденных химических композиций или полимерных материалов, химический состав которых не расшифрован, допустима постановка иммунологических реакций с водными (лучше термостатированными) вытяжками из них, но при условии санитарно-химической проверки миграции химических ингредиентов в водную среду.

Подбор рабочих доз химических аллергенов проводится для каждой соответствующей иммунологической реакции, так как чувствительность различных биосубстратов к токсическому действию химического соединения зависит не только от его вида (сыворотка крови, различные лейкоциты, эритроциты), но и от соотношения всех ингредиентов реагирующей системы. Принцип подбора рабочей зоны химического аллергена заключается в постановке соответствующей реакции параллельно с различными его разведениями (1:2 или 1:10) с кровью здоровых лиц, не сенсибилизированных данным аллергеном. Первое разведение аллергена выбирается с учетом его токсичности, а при отсутствии таких данных - начиная с 50-процентного раствора и последующих десятикратных разведений. За рабочую дозу принимается минимальное разведение аллергена, не вызывающее повреждения соответствующих клеток крови или денатурации белков сыворотки. Рабочую дозу аллергена необходимо проверить и при необходимости изменить на основании обследования достаточного числа здоровых несенсибилизированных лиц. Последующий контроль рабочей дозы с кровью больных аллергозами другой химической этиологии, не имевших контакта с данным аллергеном, позволяет провести коррекцию рабочей дозы с учетом повышенной чувствительности биосубстратов сенсибилизированного организма к токсическому действию химических соединений. Предварительно проведенная работа по подбору и контролю рабочих доз химических аллергенов позволяет использовать их в дальнейшем в соответствующих иммунологических реакциях без дополнительной проверки при условии точного воспроизведения концентрации растворов аллергенов при последующем их приготовлении и правильного их хранения (соблюдение чистоты, учет стабильности разведений и т.д.). В инструкциях по выполнению ряда иммунологических реакций с химическими аллергенами приведены отработанные и апробированные концентрации и рабочие дозы для наиболее распространенных химических аллергенов.

РЕАКЦИИ КЛЕТОК КРОВИ НА ГАПТЕН IN VITRO

РЕАКЦИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АГЛОМЕРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ (РСАЛ)

Реакция агломерации лейкоцитов периферической крови основана на эффекте усиления склеивания клеток белой крови при добавлении к ней специфического аллергена, что является одной из первых фаз специфической аллергической реакции клеток крови.

Исследуемую кровь в количестве по 0,2 мл добавляют в две центрифужные или видалевские пробирки, содержащие: 1 (опытная) - 0,04 мл 3,8-процентного раствора цитрата натрия или 1,5-процентного раствора трилона Б, в котором растворена рабочая доза аллергена, 2 (контрольная) - 0,04 мл соответствующего антикоагулянта без аллергена. Обе пробирки инкубируют в течение двух часов при 37 °С. Затем содержимое каждой пробирки (опытной и контрольной) с помощью пастеровской пипетки переносят на отдельное предметное стекло и концом пипетки, положенным параллельно поверхности стекла, готовят мазок в виде квадрата, сторона которого равна ширине стекла (не рекомендуется размешивать кровь концом пипетки). Мазки просушивают на воздухе (лучше в течение суток) и без предварительной фиксации окрашивают 0,01-процентным водным раствором метилена синего в течение 10 минут. Окрашенные препараты промывают в емкости с водой (но не под струей воды) и просушивают на воздухе. Микроскопию препаратов осуществляют при увеличении 10 х 40 (лучше с иммерсией), просчитывают по диагонали мазка 500 лейкоцитов, учитывая абсолютное число клеток, склеенных в конгломераты, - по 3 и более.

Оценка результата реакции - расчет процента агломерированных клеток в опытном и в контрольном препаратах и последующее определение показателя по формуле:

% агломерации в опыте

показатель РСАЛ = ------------------------.

% агломерации в контроле

Реакция расценивается как положительная при показателе РСАЛ 1,4 и выше. При отсутствии сенсибилизации рабочая доза аллергена не должна вызывать агломерацию интактных лейкоцитов в количестве, большем по сравнению с контролем (без аллергена), т.е. показатель РСАЛ должен соответствовать 1,0 +/- 0,3.

РАБОЧИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ И ДОЗЫ ХИМИЧЕСКИХ АЛЛЕРГЕНОВ

И АНТИБИОТИКОВ ДЛЯ РЕАКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АГЛОМЕРАЦИИ

ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ

┌────────────────────────────────────────────┬────────────┬───────────────┐

│ Аллерген │Концентрация│ Рабочая доза │

│ │ раствора │в мкг в 0,04 мл│

│ │ аллергена │антикоагулянта │

│ │ в % │на 0,2 мл крови│

├────────────────────────────────────────────┼────────────┼───────────────┤

│ 1 │ 2 │ 3 │

│Ангидрид малеиновый │0,05 │20,0 │

│Ангидрид фталевый │0,05 │20,0 │

│Бериллий сернокислый │0,001 │0,4 │

│Дифенилгуанидин │0,02 │8,0 │

│Дициандиамидформальдегидуксусная смола (ДЦУ)│0,025 │10,0 │

│Кобальт хлористый │0,05 │20,0 │

│Малеиновокислый натрий │0,1 │40,0 │

│Марганец хлористый │0,05 │20,0 │

│Метилметакрилат │0,003 │0,6 │

│бета-нафтиламин (неозон Д) │0,05 │2,0 │

│Никель хлористый │0,025 │10,0 │

│Нитрит натрия │ │ │

│Полиэфирная смола ПН-М │0,1 │40,0 │

│Хром хлорный │0,05 │20,0 │

│Формальдегид │0,05 │2,0 │

│Фуран │0,02 │8,0 │

│Эпоксидированные триэтиленгликоли - ТЕГ-1, │0,05 │2,0 │

│ТЕГ-10 │ │ │

│Антибиотики неомицинового ряда <1> │500 │20,0 │

│Антибиотики тетрациклинового ряда <1> │500 │20,0 │

│Пенициллин и полусинтетические │350 │15,0 │

│пенициллины <1> │ │ │

└────────────────────────────────────────────┴────────────┴───────────────┘

--------------------------------

<1> Рабочие дозы антибиотиков представлены в ед. активности, концентрации - в ед. активности не на 100 мл, а на 1 мл растворителя. В последующих таблицах обозначения аналогичны.

ТЕСТЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ (ППН) И АЛЬТЕРАЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ

Тесты повреждения и альтерации нейтрофилов крови основаны на иммунологическом феномене, развивающемся по типу реакции клеток-мишеней на иммунный комплекс, образующийся в сыворотке крови при добавлении к ней специфического антигена. Тест повреждения нейтрофилов регистрирует усиление их амебоидной подвижности под влиянием специфического аллергена и служит для оценки ранней фазы аллергической реакции клеток крови. Тест альтерации нейтрофилов выявляет степень аллергической дегенерации клеток и их внутриклеточных органелл, т.е. дальнейшее их изменение под влиянием аллергена. Оба метода выполняются одинаково и отличаются лишь различной окраской препаратов.

Исследуемую кровь в количестве по 0,08 мл добавляют в две центрифужные или видалевские пробирки, содержащие: 1 (опытная) - 0,02 мл 5-процентного раствора цитрата натрия, в котором растворена рабочая доза аллергена, 2 (контрольная) - 0,02 мл 5-процентного раствора цитрата натрия без аллергена. Обе пробирки инкубируют в течение двух часов при 37 °С. Затем содержимое каждой пробирки (опытной и контрольной) с помощью пастеровской пипетки переносят на отдельное предметное стекло и шлифованным краем другого стекла готовят мазки средней толщины. Для определения ППН мазки окрашивают на гликоген по А.Л. Шабадашу, а для определения альтерации нейтрофилов - любым методом, используемым при окраске мазков крови для подсчета лейкоцитарной формулы. Микроскопию препаратов проводят с иммерсией, просчитывают 100 нейтрофилов, учитывая: для ППН - клетки, имеющие псевдоподии, а для реакции альтерации - клетки с отчетливым хроматинолизом, пикнозом, фрагментацией ядер, гиперхроматозом или кариолизисом.

Оценка результата реакции - расчет показателя по формуле:

Н - Н

опыт контроль

ППН = -----------------,

100

где Н соответствует абсолютному количеству поврежденных нейтрофилов. Реакция расценивается как положительная при показателе 0,05 и выше. При отсутствии сенсибилизации рабочая доза аллергена не должна вызывать повреждения интактных нейтрофилов в количестве, большем по сравнению с контролем (без аллергена), т.е. показатель реакции должен соответствовать 0 - 0,04.

РАБОЧИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ И ДОЗЫ ХИМИЧЕСКИХ АЛЛЕРГЕНОВ

И АНТИБИОТИКОВ ДЛЯ РЕАКЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЯ И АЛЬТЕРАЦИИ

НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ

┌────────────────────────────────────┬────────────┬───────────────────────┐

│ Аллерген │Концентрация│ Рабочая доза в мкг в │

│ │ раствора │ 0,02 мл 5-процентного │

│ │ аллергена │раствора цитрата натрия│

│ │ в % │ на 0,08 мл крови │

├────────────────────────────────────┼────────────┼───────────────────────┤

│Кобальт хлористый │0,1 │20,0 │

│Никель хлористый │0,1 │20,0 │

│Марганец хлористый │0,01 │2,0 │

│Хром хлорный │0,01 │2,0 │

│Формальдегид │0,05 │10,0 │

│Антибиотики неомицинового ряда <1> │400 │8,0 │

│Антибиотики тетрациклинового │400 │8,0 │

│ряда <1> │ │ │

│Пенициллин и полусинтетические │300 │6,0 │

│пенициллины <1> │ │ │

└────────────────────────────────────┴────────────┴───────────────────────┘

РЕАКЦИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ЛИЗИСА ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ (РСЛЛ)

Реакция специфического лизиса лейкоцитов основана на учете количественного изменения сенсибилизированных клеток при действии специфического аллергена и связана с включением комплемента в реализацию формирования иммунного комплекса, происходящего на поверхности клеток и приводящего к их повреждению и лизису. С химическими аллергенами реакцию специфического лизиса лейкоцитов выполняют с использованием крови в количестве 0,2 мл.

Исследуемую кровь в количестве по 0,1 мл добавляют в две центрифужные или видалевские пробирки, содержащие: 1 (опытная) - 0,05 мл физиологического раствора, в котором растворена рабочая доза аллергена, 2 (контрольная) - 0,05 мл физиологического раствора без аллергена. Обе пробирки инкубируют в течение двух часов при 37 °С. Затем для разрушения эритроцитов кровь из опытной и контрольной пробирок в количестве по 0,02 мл переносят соответственно в две пробирки, содержащие по 0,4 мл 3-процентного водного раствора уксусной кислоты. Подсчет абсолютного количества лейкоцитов проводят в счетной камере крови (Горяева или Фукса - Розенталя).

Оценка результата реакции - расчет показателя по формуле:

Л - Л

контроль опыт

показатель РСЛЛ = ----------------- х 100,

контроль

где Л - абсолютное количество лейкоцитов. Реакция расценивается как положительная при показателе 10% и выше. При отсутствии сенсибилизации рабочая доза аллергена не должна вызывать лизис интактных лейкоцитов в количестве, большем по сравнению с контролем (без аллергена), и в среднем показатель реакции не должен превышать 9,9%.

РАБОЧИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ И ДОЗЫ ХИМИЧЕСКИХ АЛЛЕРГЕНОВ

И АНТИБИОТИКОВ ДЛЯ РЕАКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ЛИЗИСА

ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ

┌───────────────────────────────────────┬────────────┬────────────────────┐

│ Аллерген │Концентрация│Рабочая доза в мкг в│

│ │ раствора │0,05 мл физиологиче-│

│ │ аллергена │ского раствора на │

│ │ в % │0,1 мл крови │

├───────────────────────────────────────┼────────────┼────────────────────┤

│ 1 │ 2 │ 3 │

│Полидивинильный латекс СКДП │0,5 │250 │

│Формальдегид │0,5 │250 │

│Формальдегидсодержащие │0,25 │125 │

│водорастворимые смолы │ │ │

│Эпоксидная водорастворимая смола ДЕГ-1 │0,5 │250 │

│Антибиотики неомицинового ряда <1> │2000 │100 │

│Антибиотики тетрациклинового ряда <1> │2000 │100 │

│Пенициллин и полусинтетические │2000 │100 │

│пенициллины <1> │ │ │

└───────────────────────────────────────┴────────────┴────────────────────┘

РЕАКЦИЯ ПРЯМОГО СПЕЦИФИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ

БАЗОФИЛОВ КРОВИ (РСПБ)

Базофилы крови, как и тучные клетки соединительной ткани, выполняют роль клеток-мишеней в реализации аллергических реакций немедленного типа. Поскольку на поверхности этих клеток фиксированы гомоцитотропные антитела, образование иммунного комплекса приводит к нарушению проницаемости клеточных мембран, активации секреторной функции (выбросу в кровь биогенных аминов) и к повреждению этих клеток. С химическими аллергенами реакцию прямого специфического повреждения базофилов крови выполняют с помощью технически простых приемов постановки, приготовления фиксированных мазков-препаратов и количественной оценки результата по показателю реакции.

Исследуемую кровь в количестве 5,0 мл добавляют в центрифужную пробирку, содержащую 5 капель 6-процентного водного раствора трилона Б, и инкубируют в течение одного часа при 37 °С. Образовавшуюся взвесь лейкоцитов с помощью пастеровской пипетки переносят в чистую пробирку и затем разливают ее в две центрифужные пробирки по 0,3 мл. В 1 пробирку (опытную) добавляют 0,1 мл физиологического раствора, в котором растворена рабочая доза аллергена, во 2 (контрольную) - 0,1 мл физиологического раствора без аллергена. Обе пробирки инкубируют в течение 10 минут при 37 °С и затем центрифугируют в течение 10 минут при 1500 оборотах/мин. Затем, переворачивая пробирки, сливают из них всю надосадочную жидкость (промокая край пробирки фильтровальной бумагой), а лейкоцитарную массу, полностью сохраняющуюся на дне в виде осадка, осторожно, постукивая пальцем по пробирке, разбивают в остатке жидкости, стекающей со стенок. Содержимое каждой пробирки (опытной и контрольной) с помощью пастеровской пипетки переносят на отдельное предметное стекло (в виде капли на край) и шлифованным краем другого стекла готовят тонкие лейкоцитарные мазки. Окраску мазков осуществляют сразу после их просушивания на воздухе реактивом эозин-метиленовый синий по Май - Грюнвальду в течение одной-двух минут (не перекрашивать!) с последующим промыванием в метиловом спирте (не в воде!). Микроскопию мазков-препаратов проводят с иммерсией (увеличение 10 х 80), просчитывают по краям мазка 50 базофилов, учитывая число поврежденных клеток. Поврежденными следует считать клетки с нарушением равномерного распределения гранул, с псевдоподиями, с выходом отдельных гранул за пределы клеточной цитоплазмы и полностью поврежденные.

Оценка результата реакции - расчет процента поврежденных клеток в опытном и контрольном препаратах и последующее определение показателя по формуле:

% поврежденных базофилов в опыте

показатель РСПБ = -----------------------------------.

% поврежденных базофилов в контроле

Реакция расценивается как положительная при показателе 1,4 и выше. При отсутствии сенсибилизации рабочая доза аллергена не должна вызывать повреждения интактных базофилов в количестве, большем по сравнению с контролем (без аллергена), т.е. показатель РСПБ должен соответствовать 1,0 +/- 0,3.

РАБОЧИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ И ДОЗЫ ХИМИЧЕСКИХ АЛЛЕРГЕНОВ

И АНТИБИОТИКОВ ДЛЯ РЕАКЦИИ ПРЯМОГО СПЕЦИФИЧЕСКОГО

ПОВРЕЖДЕНИЯ БАЗОФИЛОВ КРОВИ

┌────────────────────────────────────────┬────────────┬───────────────────┐

│ Аллерген │Концентрация│Рабочая доза в мкг │

│ │ раствора │в 0,1 мл физиологи-│

│ │ аллергена │ческого раствора на│

│ │ в % │0,3 мл крови │

├────────────────────────────────────────┼────────────┼───────────────────┤

│Кобальт хлористый │0,05 │5,0 │

│Марганец хлористый │0,05 │5,0 │

│Никель хлористый │0,01 │1,0 │

│Формальдегид │0,005 │0,5 │

│Хром хлорный │0,05 │5,0 │

│Эпихлоргидрин │0,05 │5,0 │

│Пенициллин и полусинтетические │100 │10,0 │

│пенициллины <1> │ │ │

└────────────────────────────────────────┴────────────┴───────────────────┘

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ С ХИМИЧЕСКИМИ АЛЛЕРГЕНАМИ

РЕАКЦИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ МИКРОПРЕЦИПИТАЦИИ

В ЖИДКОЙ СРЕДЕ (РСМП)

Реакция специфической микропреципитации в жидкой среде основана на нефелометрическом определении иммунного комплекса (микропреципитата), образующегося при последовательном добавлении в плазму крови разведений специфического аллергена. С химическими аллергенами реакцию специфической микропреципитации выполняют с приготовлением шкалы разведений аллергена из его максимальной неденатурирующей концентрации и с оценкой результата реакции по титру гаптена. Приборы для нефелометрии: фотоэлектроколориметр ФЭК 56 М (светофильтр N 4) или спектрофотометр СФ 4А.

Приготовление плазмы исследуемой крови проводят путем центрифугирования цитратной крови (на 2,5 мл крови 0,5 мл 5-процентного раствора цитрата натрия) в течение 15 минут при 2500 оборотах/мин. Полученную плазму с помощью пастеровской пипетки переносят в чистую пробирку и разводят дистиллированной водой 1:2, что приводит к уровню ее исходной оптической плотности в диапазоне 0,350 - 0,500 экстинций на фотоэлектроколориметре или длине волны около 500 нм на спектрофотометре. Для достижения равновесного состояния разведенной плазмы необходимо ее выдерживание при комнатной температуре в течение 15 - 20 минут, после чего регистрируют исходную оптическую плотность порции плазмы, а затем - через 2 минуты после добавления к ней каждого разведения аллергена (от 1:256 до 1:2). Объемы реагирующей системы должны соответствовать: 1,8 мл разведенной плазмы и по 0,1 мл каждого разведения аллергена (в кюветах с шириной ребра 5 мм), удобно также использовать объемы 3,6 мл и по 0,2 мл соответственно (в кюветах с шириной ребра 10 мм). При работе с окрашенными или мутными разведениями аллергена необходимо одновременное добавление соответствующего разведения в контрольную кювету с дистиллированной водой.

Учет результата реакции проводят путем записи цифровых показателей оптической плотности реагирующей системы. В случае отрицательного результата добавление всех разведений аллергена сопровождается неуклонным снижением оптической плотности реагирующей системы в диапазоне 0,020 - 0,005 экстинций по сравнению с каждым предыдущим показателем. Положительная реакция (образование специфического микропреципитата) сопровождается задержкой просветления (снижение на 0,003 - 0,001 экстинций), отсутствием изменения или повышением оптической плотности реагирующей системы. Первое из 8-ми разведений аллергена, добавление которого сопровождается данным эффектом, принимается за титр реакции.

Подбор исходной концентрации аллергена для приготовления шкалы разведений осуществляют путем регистрации оптической плотности нескольких порций плазмы интактной крови после однократного добавления к каждой из них одного из последовательных его разведений (1:2 или 1:10). За исходную неденатурирующую концентрацию аллергена принимается первое разведение, не вызывающее задержки просветления или повышения оптической плотности плазмы. При подборе исходной неденатурирующей концентрации аллергена объемы реагирующей системы и условия нефелометрии должны соответствовать условиям выполнения реакции. Шкалу из 8-ми последовательных двойных разведений аллергена, приготовленных из исходной неденатурирующей концентрации, необходимо многократно проверить с плазмой интактной крови по схеме выполнения реакции, т.е. при последовательном добавлении к порции плазмы всех разведений шкалы аллергена (от 1:256 до 1:2).

ИСХОДНЫЕ НЕДЕНАТУРИРУЮЩИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ХИМИЧЕСКИХ АЛЛЕРГЕНОВ

ДЛЯ РЕАКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ МИКРОПРЕЦИПИТАЦИИ В ЖИДКОЙ СРЕДЕ

┌─────────────────────────────────┬───────────┬─────────────┬─────────────┐

│ Химический аллерген │Пороговая, │Максимальная,│Максимальная │

│ │денатуриру-│неденатуриру-│рабочая (раз-│

│ │ющая белки │ющая белки │ведение 1:2) │

├─────────────────────────────────┼───────────┼─────────────┼─────────────┤

│Бериллий сернокислый │0,2 │0,1 │0,05 │

│Бихромат калия │0,5 │0,2 │0,1 │

│Дициандиамидформальдегидная смола│0,1 │0,05 │0,02 │

│(ДЦУ) │ │ │ │

│Карбамол │2,0 │1,0 │0,5 │

│Кобальт хлористый │2,5 │1,0 │0,5 │

│Малеиновокислый натрий │5,0 │2,0 │1,0 │

│Марганец хлористый │2,5 │1,0 │0,5 │

│Никель хлористый │2,5 │1,0 │0,5 │

│Полидивинильный латекс │0,2 │0,1 │0,05 │

│СКДП │ │ │ │

│Полиэфирная смола ПН-М │1,0 │0,5 │0,2 │

│Триэтаноламин │5,0 │2,0 │1,0 │

│Триэтиленгликоль эпоксидированный│0,5 │0,2 │0,1 │

│(ТЕГ-1, ТЕГ-10) │ │ │ │

│Формальдегид │5,0 │2,0 │1,0 │

│Хром хлорный │0,5 │0,2 │0,1 │

│Эпихлоргидрин │- │5,0 │2,0 │

│Эпоксидная смола ДЕГ-1 │0,5 │0,2 │0,1 │

└─────────────────────────────────┴───────────┴─────────────┴─────────────┘

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

Реакция связывания комплемента основана на адсорбции комплемента иммунным комплексом, образующимся при взаимодействии антител сыворотки крови со специфическим аллергеном. В качестве индикатора для определения снижения количества комплемента используют гемолитическую систему, поскольку эритроциты, сенсибилизированные гемолизином, способны лизироваться только в присутствии комплемента с химическими аллергенами, реакцию связывания комплемента выполняют в микротитраторе типа Такаччи в титрационных пластинах с лунками, имеющими полукруглое дно, и со всеми ингредиентами реагирующей системы в объеме по 0,02 мл.

Приготовление гемолитической системы осуществляют ex tempore путем разведения сухой гемолитической сыворотки физиологическим раствором до титра, в три раза ниже рабочего, и смешивания ее со свежими эритроцитами барана в соотношении 10 и 0,3 мл (3-процентная взвесь).

Определение рабочего титра комплемента проводят один раз для всей серии сухого комплемента. В лунку титрационной пластины вносят 2 капли комплемента, разведенного физиологическим раствором в соотношении 1:2, и готовят последовательные двойные его разведения до 1:64. Во все лунки добавляют по 1 капле гемолитической системы и по 2 капли физиологического раствора и инкубируют смесь в течение часа при 37 °С. За рабочий титр комплемента принимают его разведение, вызывающее умеренный гемолиз, - розовое окрашивание жидкой среды при наличии небольшого осадка нелизированных эритроцитов.

Основной опыт по определению антигаптенных комплементсвязывающих антител в микромодификации РСК предусматривает:

1 - инактивацию исследуемой сыворотки в течение 30 минут при 56 °С и приготовление двух параллельных рядов ее двукратных разведений, начиная с 1:10;

2 - добавление к первому ряду разведений сыворотки (контроль сыворотки) по 1 капле физиологического раствора, ко второму ряду (опыт) - по 1 капле химического аллергена в рабочей концентрации; затем добавление во все лунки по 1 капле комплемента в рабочем титре и инкубацию в течение часа при 37 °С;

3 - последующее добавление во все лунки по 1 капле гемолитической системы и повторную инкубацию в течение часа при 37 °С.

При постановке основного опыта в четырех лунках титрационной пластины необходимы следующие дополнительные контроли реакции:

а) контроль на качество эритроцитов - 3 капли физиологического раствора + 1 капля гемолитической системы (эритроциты должны осесть плотным кружком на дне лунки);

б) контроль на цитотоксическое действие химического аллергена - 2 капли физиологического раствора + 1 капля аллергена в рабочей концентрации + 1 капля гемолитической системы (эритроциты должны осесть как в контроле "а");

в) контроль рабочего титра комплемента - 2 капли физиологического раствора + 1 капля комплемента в рабочем титре + 1 капля гемолитической системы (умеренный гемолиз при наличии небольшого осадка нелизированных лейкоцитов);

г) контроль на антикомплементарность аллергена - 1 капля физиологического раствора + 1 капля аллергена в рабочей концентрации + 1 капля комплемента + 1 капля гемолитической системы (лизис должен быть как в контроле "в").

Результаты реакции оценивают с учетом всех контролей после дополнительного выдерживания титрационных пластин в течение одного часа на холоде (+4 °С) для лучшего оседания нелизированных лейкоцитов. За титр положительной реакции принимают максимальное разведение сыворотки, где еще имеет место задержка реакции гемолиза.

Подбор рабочей концентрации химического аллергена для реакции связывания комплемента проводят в два этапа.

Исключение цитотоксического действия аллергена. В лунку титрационной пластины вносят 2 капли аллергена, разведенного физиологическим раствором 1:2 или 1:10, готовят последующие двойные разведения аллергена и во все лунки добавляют по 2 капли физиологического раствора и по 1 капле гемолитической системы. Контролем служит лунка с 1 каплей гемолитической системы и 3 каплями физиологического раствора. После инкубации в течение часа при 37 °С устанавливают концентрацию аллергена, которая не вызывает гемолиза или дубления эритроцитов.

Исключение антикомплементарности аллергена. В лунку титрационной пластины вносят 2 капли аллергена в концентрации, не оказывающей цитотоксического действия на эритроциты, и готовят последующие двойные его разведения на физиологическом растворе. Во все лунки добавляют по 1 капле комплемента в рабочем титре (вызывающем умеренный гемолиз), по 1 капле физиологического раствора и инкубируют в течение часа при 37 °С. Затем во все лунки добавляют по 1 капле гемолитической системы и повторно инкубируют в течение часа при 37 °С. Контролем служит лунка с 1 каплей комплемента, 1 каплей гемолитической системы и 2 каплями физиологического раствора. Рабочая концентрация химического аллергена не должна вызывать задержки или усиления гемолиза по сравнению с контролем.

РАБОЧИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ И ДОЗЫ ХИМИЧЕСКИХ АЛЛЕРГЕНОВ

ДЛЯ МИКРОМОДИФИКАЦИИ РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

┌──────────────────────────────┬───────────────┬──────────────────────────┐

│ Химический аллерген │ Концентрация │ Рабочая доза в мкг │

│ │ раствора │в 0,02 мл физиологического│

│ │ аллергена в % │ раствора │

├──────────────────────────────┼───────────────┼──────────────────────────┤

│Бериллий сернокислый │0,001 │0,2 │

│Кобальт хлористый │0,005 │1,0 │

│Марганец хлористый │0,005 │1,0 │

│Никель хлористый │0,001 │0,2 │

│Хром хлорный │0,001 │0,2 │

│Формальдегид │0,001 │0,2 │

└──────────────────────────────┴───────────────┴──────────────────────────┘

РЕАКЦИЯ ПАССИВНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РПГА)

Реакция пассивной гемагглютинации основана на феномене агглютинации гетерологичных эритроцитов, сенсибилизированных in vitro химическим аллергеном (так называемых эритроцитарных диагностикумов), при их добавлении к сыворотке крови, содержащей соответствующие антигаптенные антитела. Приготовление эритроцитарных диагностикумов является наиболее ответственным этапом выполнения реакции и предусматривает:

1. Отмывание свежих эритроцитов барана физиологическим раствором и центрифугирование в течение 7 минут при 1500 оборотах/мин.

2. Таннизацию отмытых эритроцитов добавлением к 0,05 мл их осадка 2,5 мл таннина, разведенного фосфатным буфером с pH = 7,2 до 1:40000 - 1:60000, и инкубацию в течение 20 минут при 37 °С.

3. Отмывание таннизированных эритроцитов 10 мл того же буфера и центрифугирование в течение 7 минут при 1500 оборотах/мин.

4. Разведение таннизированных отмытых эритроцитов до 1-процентной суспензии 5 мл физиологического раствора, в который добавлен гепарин в дозе 1 - 2 ед./мл.

5. Сенсибилизацию таннизированных эритроцитов in vitro химическим аллергеном:

с водонерастворимыми химическими аллергенами проводят путем добавления к 5 мл 1-процентной суспензии таннизированных эритроцитов, охлажденной в течение 10 минут в емкости со льдом, 0,02 мл охлажденного при +4 °С ацетона, в котором растворена рабочая доза аллергена, с последующим перемешиванием и инкубацией на холоде в течение 30 - 40 минут;

с водорастворимыми химическими аллергенами проводят путем добавления к 5 мл 1-процентной суспензии таннизированных эритроцитов 0,02 - 0,08 мл водного раствора аллергена и инкубацией в течение 30 минут при 37 °С.

Эритроцитарные диагностикумы можно также готовить с применением в качестве стабилизатора глютарового альдегида, что позволяет использовать их не ex tempore, а в течение 3 - 4 недель. Для этого к суспензии 0,05 мл осадка отмытых эритроцитов в 4 мл физиологического раствора по каплям и при перемешивании добавляют 1,5 мл рабочего раствора глютарового альдегида (25-процентный раствор, разведенный ex tempore физиологическим раствором до 1:100) с последующей инкубацией в течение 15 минут при 37 °С. Последующую сенсибилизацию эритроцитов осуществляют добавлением к ним 0,025 мл водного раствора аллергена в рабочей дозе с инкубацией в течение 30 - 40 минут при комнатной температуре.

7. Отмывание осадка сенсибилизированных эритроцитов разводящей жидкостью (0,2-процентный раствор желатины на физиологическом растворе с pH = 6,6 - 6,7).

РАБОЧИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ И ДОЗЫ ХИМИЧЕСКИХ АЛЛЕРГЕНОВ

ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ

┌───────────────────────────────┬────────────┬─────────────┬──────────────┐

│ Химический аллерген │Растворитель│Концентрация │Рабочая доза в│

│ │ │ раствора │мкг в 0,02 мл │

│ │ │аллергена в %│ растворителя │

├───────────────────────────────┼────────────┼─────────────┼──────────────┤

│Бериллий хлористый │вода │0,12 │30 │

│Гексаметилендиамин │ацетон │1,0 │200 │

│Диметилтерифталат │ацетон │4,0 │800 │

│Динитрохлорбензол │ацетон │1,0 │200 │

│Кобальт хлористый │вода │1,0 │100 │

│Марганец хлористый │вода │1,0 │100 │

│Никель хлористый │вода │0,1 │20 │

│Парафенилендиамин │ацетон │0,5 │100 │

│Фуран │вода │0,25 │50 │

│Хром хлорный │вода │0,01 │2 │

│Эпихлоргидрин │ацетон │2,0 │400 │

│Эпоксидная смола ДЕГ-1 │вода │1,0 │200 │

└───────────────────────────────┴────────────┴─────────────┴──────────────┘

Приготовленный эритроцитарный диагностикум используют в реакции в виде 1-процентной взвеси эритроцитов при пробирочной методике постановки или 0,5-процентной взвеси при микрометодике в титрационных пластинах микротитратора типа Такаччи.

Исследуемую сыворотку в объеме 0,5 - 1 мл инактивируют в течение 30 минут при 56 °С для разрушения гемолизинов, разводят физиологическим раствором 1:2 и три раза адсорбируют, добавляя к 1 мл разведенной сыворотки по 1 - 3 капле осадка отмытых эритроцитов барана, перемешивают, инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре и центрифугируют в течение 7 минут при 1500 оборотах/мин. Из инактивированной и адсорбированной сыворотки готовят ряд двойных разведений на разводящей жидкости (0,2-процентный раствор желатины на физиологическом растворе), начиная с 1:2, и добавляют приготовленный эритроцитарный диагностикум. Объемы реагирующей системы при пробирочной методике - 0,5 мл сыворотки и 0,05 мл эритроцитов, при микрометодике - 0,05 и 0,025 мл соответственно.

Контроли реакции:

1 - на полноту истощения сыворотки - готовят параллельный ряд двойных разведений исследуемой сыворотки (по 0,5 мл или 0,05 мл) и добавляют таннизированные или обработанные глютаровым альдегидом эритроциты (по 0,5 или 0,025 мл);

2 - на спонтанную агглютинацию таннизированных или обработанных глютаровым альдегидом эритроцитов - в разводящую жидкость (0,5 мл или 0,05 мл) добавляют таннизированные или обработанные глютаровым альдегидом эритроциты (по 0,5 мл или 0,025 мл);

3 - на спонтанную агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов - в разводящую жидкость (0,5 или 0,05 мл) добавляют сенсибилизированные эритроциты (по 0,5 мл или 0,025 мл).

Инкубацию реагирующей системы проводят при пробирочной методике в течение 60 минут при 37 °С и затем в течение 18 часов при комнатной температуре, при микрометодике - в течение 60 минут при 37 °С или 90 минут при комнатной температуре.

Результат реакции оценивают с учетом всех контролей по титру, соответствующему последнему разведению исследуемой сыворотки, где еще имеет место агглютинация эритроцитарного диагностикума. Отрицательная реакция (отсутствие агглютинации) - эритроциты осаждаются в виде плотного темно-красного кружка; реакция агглютинации проявляется в виде размытого и неровного осадка эритроцитов, причем при выраженной реакции осадок распадается на отдельные гранулы, при слабой - размытый круг или кольцо с неровными зазубренными краями. В контроле на полноту истощения сыворотки допускается появление слабо выраженной агглютинации в первых разведениях, но в таком случае учет реакции следует начинать лишь с титра сыворотки, в 4 раза выше ее титра, вызвавшего агглютинацию эритроцитов в контроле.

СПЕЦИФИЧЕСКИЕ КЛЕТОЧНЫЕ РЕАКЦИИ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

IN VITRO

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ПРИЛИПАНИЯ КЛЕТОК (РТПК)

Некоторые популяции иммунокомпетентных клеток, в том числе макрофаги, обладают способностью прилипать к гладкой стеклянной поверхности, в связи с чем они получили название прилипающих клеток (А - адгеренс). Однако сенсибилизированные клетки, несущие на своей поверхности антигенные детерминанты, теряют способность прилипать к стеклу, и на этом феномене основана реакция торможения прилипания клеток.

Из 10 мл исследуемой гепаринизированной крови получают плазму путем ее

отстаивания в течение 30 минут при 37 °С и все последующие манипуляции

выполняют в силиконированной посуде. Из полученной плазмы выделяют

лимфоциты с помощью верографина, наслаивая 5 мл плазмы на 5 мл

14,3-процентного раствора верографина с pH = 7,35. После центрифугирования

в течение 40 минут при 1500 оборотах/мин. с помощью пастеровской пипетки

забирают кольцо лимфоцитов, расположенное на границе плазмы и верографина в

виде зоны помутнения. Затем под контролем подсчета в камере Горяева готовят

взвесь, содержащую 1 - 2 х 10 клеток в 1 мл питательной среды 199 для

культуры тканей. В две видалевские пробирки вносят по 0,05 мл

приготовленной взвеси клеток и добавляют в 1 (опытную) 0,05 мл

физиологического раствора, в котором растворена рабочая доза аллергена, во

2 (контрольную) - 0,05 мл физиологического раствора без аллергена. Обе

пробирки инкубируют в течение 30 минут при 37 °С. Воздухом с помощью

пастеровской пипетки с грушей осторожно ресуспендируют осадок и содержимым

каждой пробирки (опытной и контрольной) заполняют две счетные камеры крови

(Горяева), которые в горизонтальном положении инкубируют во влажных чашках

Петри в течение часа при 37 °С, после чего подсчитывают абсолютное

количество клеток в каждой камере. После проведенного подсчета камеры

помещают в горизонтальном положении в чашки Петри, заполненные

физиологическим раствором, и поднявшиеся при этом покровные стекла удаляют

пинцетом. Затем обе камеры в вертикальном положении погружают в емкость с

физиологическим раствором, после чего их вынимают, переводят в

горизонтальное положение, наносят на их поверхность каплю физиологического

раствора, накрывают покровным стеклом и инкубируют в течение 30 минут при

37 °С. Затем подсчитывают число оставшихся клеток и рассчитывают процент

прилипших клеток в опытной и в контрольной камерах по отношению к

количеству клеток в них до отмывания физиологическим раствором.

Оценка результата реакции - по степени снижения количества прилипших

макрофагов в присутствии специфического аллергена:

показатель РТПК = % ПК в контроле - % ПК в опыте,

где ПК - абсолютное количество клеток, прилипших к стеклянной

поверхности. При отсутствии сенсибилизации эффект торможения прилипания

макрофагов соответствует 0 или не более 3%, т.е. рабочая доза аллергена не

должна вызывать торможения прилипания интактных клеток по сравнению с

контролем (без аллергена). Рабочая доза хлорного хрома (CrCl ) для РТПК

соответствует 0,1-процентному раствору (водному).

РЕАКЦИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО РОЗЕТКООБРАЗОВАНИЯ (РОК)

Наличие на поверхности сенсибилизированных лимфоцитов рецепторов, специфичных к соответствующему аллергену, позволяет определить количество специфических розеткообразующих клеток при использовании корпускулярного носителя с соответствующими химическими детерминантами, т.е. в реакции специфического розеткообразования. При этом в качестве корпускулярного носителя наиболее целесообразно использовать не эритроциты барана, а зимозан (биополимер из оболочки дрожжевых клеток, состоящий преимущественно из глюкона). С химическими аллергенами реакцию специфического розеткообразования выполняют с приготовлением фиксированных и окрашенных мазков, что позволяет сохранять препараты и облегчает учет результата.

Из 10 мл гепаринизированной крови получают плазму путем ее отстаивания

в течение 30 минут при 37 °С и все последующие манипуляции выполняют в

силиконированной посуде. Из полученной плазмы выделяют лимфоциты с помощью

верографина, наслаивая 5 мл плазмы на 5 мл 14,3-процентного раствора

верографина с pH = 7,35. После центрифугирования в течение 40 минут при

1500 оборотах/мин. с помощью пастеровской пипетки забирают кольцо

лимфоцитов, расположенное на границе плазмы и верографина в виде зоны

помутнения. Клетки отмывают дважды в питательной среде 199 путем

центрифугирования в течение 5 минут при 1500 оборотах/мин., ресуспендируют

их в 1 мл питательной среды. После подсчета числа клеток в камере Горяева

готовят взвесь лимфоцитов, содержащую 2 - 2 х 10 клеток в 1 мл питательной

среды. Комплекс зимозан - гаптен готовят путем смешивания в равных объемах

по 5 мл 0,1-процентной взвеси зимозана в физиологическом растворе и

раствора химического аллергена в рабочей дозе. Смесь инкубируют в течение

30 мин. при 37 °С, для удаления избытка аллергена отмывают дважды

физиологическим раствором путем центрифугирования в течение 5 минут при

1500 оборотах/мин., а затем ресуспендируют в 3 мл физиологического

раствора. Смешивание взвеси лимфоцитов и комплекса зимозан - гаптен

проводят в объемах по 0,1 мл в видалевских пробирках, немедленно

центрифугируют в течение 5 минут при 1000 оборотах/мин., добавляют 0,05 мл

3-процентного раствора глютарового альдегида для фиксации образовавшихся

розеток и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем,

не перемешивая, добавляют до края пробирки дистиллированную воду,

немедленно центрифугируют в течение 5 минут при 1000 оборотах/мин. и с

помощью пастеровской пипетки удаляют надосадочную жидкость. Из полученного

осадка с помощью пастеровской пипетки готовят мазок на обезжиренном,

охлажденном и запотевшем предметном стекле, просушивают на воздухе и

фиксируют в метиловом спирте в течение 10 минут. После промывания в течение

2 минут в дистиллированной воде мазки окрашивают по Браше или

гематоксилен-эозином. К готовым мазкам с помощью канадского бальзама

приклеивают покровные стекла. Микроскопию препаратов проводят с

иммерсионной системой, просчитывают 100 лимфоцитов, учитывая из них число

клеток с прикрепленными к ним 3-мя и более частицами зимозана, которые и

являются специфическими розеткообразующими клетками.

Оценка результата реакции: расчет процента специфических розеткообразующих клеток. Реакция расценивается как положительная при превышении процента розеткообразующих клеток по сравнению с контролем на специфичность. При отсутствии сенсибилизации процент розеткообразующих клеток соответствует 0.

Подбор рабочей дозы химического аллергена для приготовления комплекса

зимозан - гаптен осуществляют с учетом его токсичности, но для большинства

аллергенов - начиная с 1:5. Рабочая доза хлорного хрома (CrCl ) для

приготовления комплекса зимозан - гаптен соответствует 0,1-процентному

водному раствору.

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИГРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ (РТМЛ)

Реакция торможения миграции лейкоцитов крови является пробирочным аналогом гиперчувствительности замедленного типа и основана на действии выделяемого Т-лимфоцитами лимфокина - фактора, ингибирующего миграцию клеток (МИФ). С химическими аллергенами реакцию торможения миграции лейкоцитов крови выполняют с использованием меньшего объема крови (7 - 8 мл вместо 15 - 20) и с применением в качестве камер для культивирования специальных стеклянных чашек (диаметр 10 мм, высота 8 мм с плоским дном, которые помещают на время культивирования в штативы из органического стекла с крышкой). Реакцию выполняют в стерильных условиях.

Венозную кровь в количестве 7 - 8 мл добавляют в стерильную пробирку, содержащую гепарин из расчета 5 ед./мл крови. После спонтанного оседания клеточных элементов в течение 1 часа при 37 °С слой плазмы с клетками пастеровской пипеткой переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 - 7 минут при 1000 об./мин. в лабораторной центрифуге с вертикальным ротором. Удаляют надосадочную жидкость (плазму), в осадке лизируют эритроциты путем добавления 5 мл 0,35-процентного охлажденного раствора NaCl и мягкого, но тщательного пипетирования на холоде в течение 30 сек. Затем для доведения раствора до изотонического добавляют 0,6 мл 5-процентного раствора NaCl. Для очищения лейкоцитов от остатков эритроцитов взвесь центрифугируют при прежнем режиме, надосадочную жидкость удаляют и клетки взвешивают в 5 мл питательной среды N 199 на растворе Хенкса.

Перед заполнением капилляров клетки дважды отмывают питательной средой при прежнем режиме и ресуспендируют в равном объеме среды. Полученную взвесь насасывают с помощью гибкой резиновой трубки с небольшим отверстием на конце (можно использовать трубки из системы для переливания крови) в капилляры из тонкого стекла длиной 10 см и диаметром 0,7 мм. Осторожно запаивают один конец капилляра и помещают этим концом вниз в центрифужные пробирки. Для осаждения лейкоцитов капилляры в центрифужных пробирках центрифугируют в течение 4 минут при 750 об./мин. Затем часть капилляра с лейкоцитами нарезают резчиком для вскрытия ампул на отрезки длиной 4 мм и помещают в камеры для культивирования - в стеклянные чашки диаметром 10 мм и высотой 8 мм с плоским дном. Капилляры прикрепляют ко дну камеры вазелином таким образом, чтобы клетки мигрировали с обоих концов капилляра. Затем камеру заполняют питательной средой (без добавления сыворотки) и добавляют раствор аллергена. Контрольные капилляры помещают в камеру с питательной средой без аллергена. Чашки укладывают в штатив из оргстекла с крышкой, герметизируют расплавленным парафином и инкубируют в течение 24 часов при 37 °С.

Оценка результата реакции: зоны миграции зарисовывают на плотной стандартной бумаге с помощью фотоувеличителя для фотопластин или аппарата "Микрофот" типа 5ПО-1 для чтения микрофильмов, вырезают зарисованные зоны миграции и определяют вес образцов в мг. Индекс миграции рассчитывают по формуле:

индекс РТМЛ = --,

где:

Р - средний вес 4 опытных образцов;

Р - средний вес контрольных образцов.

За нормальный показатель принимается индекс миграции в диапазоне 0,7 - 1,2, индекс миграции менее 0,7 свидетельствует о торможении миграции лейкоцитов исследуемой крови, а выше 1,2 - о ее стимуляции.

В отличие от классического варианта постановки РТМЛ, существует более простая методика с использованием цельной венозной крови и кассетных миграционных патронов с микрокапиллярами диаметром не более 0,2 мм и длиной 3 - 5 см.

В стерильную пробирку, содержащую гепарин из расчета 5 ед./мл крови, добавляют 1 мл венозной крови. После быстрого и тщательного перемешивания кровь в количестве по 0,2 мл наносят на часовые стекла и добавляют по 0,05 мл физиологического раствора, в котором растворена рабочая доза химического аллергена; в качестве контроля к 0,2 мл исследуемой крови добавляют 0,05 мл физиологического раствора (без аллергена). В каждую смесь погружают один конец миграционных капилляров, затем оба конца капилляров закрывают свежеприготовленным цементом "фосфат" и центрифугируют в течение 5 мин. при 2800 об./мин. В результате центрифугирования образуется слой лейкоцитов над значительно большим слоем эритроцитов. Миграционные капилляры инкубируют в термостате при 37 °С в течение 15 - 17 часов, располагая их под углом в 10°. Оценку реакции проводят под микроскопом при малом увеличении. В окуляр вставляют специальную сетку и линейку для оценки реакции. Размеры зоны миграции лейкоцитов оценивают по количеству квадратов сетки, полностью заполненных лейкоцитами. Для каждой исследуемой пробы определяют среднюю величину из показаний в каждом из 5 квадратов одного кассетного миграционного патрона.

Оценка результата реакции: если реакция в опыте отличается от контроля более чем на 50% - положительная, на 49 - 30% - слабо положительная, менее чем на 30% - отрицательная.

При отсутствии сенсибилизации рабочая доза аллергена не должна вызывать

торможения или стимуляции интактных лейкоцитов по сравнению с контролем

(без аллергена), т.е. индекс миграции должен соответствовать диапазону 0,7

- 1,2 при классической методике постановки реакции и менее 30% при

микрометодике. Для сернокислого бериллия (BeSO ) рабочая доза при

классической постановке реакции соответствует 2,4 мкг/мл питательной среды

199, для формальдегида рабочая доза при микрометодике РТМЛ соответствует 50

мкг на 0,2 мл исследуемой крови.