Утверждаю
Заместитель
Главного
государственного
санитарного врача
СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
27 ноября 1984 г. N
3158-84
ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИЙ ПОКОЯЩИХСЯ СПОР
ЭНТОМОФТОРОВЫХ ГРИБОВ (МИКОАФИДИНА, ЭНТОМОФТОРИНА)
МЕТОДОМ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
Энтомофторовые
грибы, в частности
Entomophthora
thaxteriana,
используются для
производства средств защиты
растений (микоафидина,
энтомофторина и др.).
В состав микоафидина входят
покоящиеся споры
7
указанного вида гриба (не менее 4 x 10 в 1 г), фрагменты мицелия и остатки
питательной
среды. Препарат представляет
собой мелкодисперсный аморфный
порошок
желтого или бежевого цвета, имеющий слабый специфический (грибной)
запах.
Гигроскопичен. В воде образует нестойкую суспензию. У энтомофторина
состав и свойства подобны описанным.
Токсичность микоафидина
и энтомофторина низкая: ЛД для белых мышей и
50
крыс при введении
в желудок превышает 10 г/кг. ПДК (ориентировочная) в
3
воздухе рабочей зоны - 5 x
10 спор/куб. м.
Микоафидин и энтомофторин используются в качестве
конкретных инсектицидов против тлей. Препараты применяются методом опрыскивания
вегетирующих растений.
1. Методика
определения покоящихся спор
энтомофторовых грибов в воздухе методом световой
микроскопии
1.1.
Основные положения
1. Метод основан на
осаждении аэрозоля на аналитические фильтры типа АФА
из перхлорвинила, просветлении фильтров в парах ацетона, подсчете покоящихся
спор энтомофторовых грибов на фильтрах методом
микроскопии в проходящем свете, расчете содержания спор в воздухе.
2
2. Диапазон
определяемых количеств спор на фильтре -
12 x 10 - 6 x
5
10 .
2
3. Предел
обнаружения спор на фильтре - 5 x 10 .
4. Среднее значение
определения стандартных количеств спор - 82%.
5. Стандартное
отклонение отдельного определения - 26,1%.
6. Относительное
стандартное отклонение - 0,2.
7. Доверительный
интервал среднего при P = 0,05 и n = 5 - +/- 29,4%.
8. Метод избирателен
в присутствии посторонней микрофлоры, минеральных и органических частиц. Мешает
определению избыток пыли на фильтре - если ее количество превышает 3 - 5 мг.
1.2.
Реактивы и материалы
Ацетон хч, ГОСТ 2603-79.
Этанол
96-процентный, ТУ 6-09-1710-77.
Эфир диэтиловый (для наркоза), Фармакопея СССР.
Вода
дистиллированная, ГОСТ 6702-72.
Мешки
полиэтиленовые хозяйственные, ОСТ 6-19-37-033-82.
Формалин,
Фармакопея СССР.
Фильтры АФА-ВП-20
или АФА-ХП-20.
Вата обезжиренная медицинская, ГОСТ 5566-75.
1.3. Приборы,
аппаратура и посуда
Аспирационное
устройство, ТУ 64-1-862-77.
Аллонжи ИРА-2000,
ТУ 690-00-00.
Трубки
соединительные резиновые.
Микроскоп МБИ-3 и
т.п.
Стекла предметные.
Стекла покровные,
24 x 24 мм, ГОСТ 6672-75.
x
Микрометр
окулярный винтовой МОВ-1-15 , ГОСТ 7865-56.
Объект-микрометр
ОМП, ГОСТ 7513-75.
Кювета
металлическая (150 x 100 x 30 мм) со стеклянной крышкой.
Баня водяная, ТУ
64-1-2850-76.
Колбы конические на
100 мл, ГОСТ 10394-72.
1.4.
Подготовка к определению
Отбор,
транспортировку, хранение и анализ проб проводят при соблюдении правил
асептики. Аналитические аэрозольные фильтры и аллонжи стерилизуют в парах
формальдегида (в полиэтиленовых мешках, завернутыми в
бумагу) в течение 24 часов при комнатной температуре. Площадь поля зрения
микроскопа определяют при помощи микрометра окулярного и объект-микрометра.
Предметные и покровные стекла обрабатывают смесью этанола с эфиром (1:1).
1.5. Отбор
проб
Улавливание спор энтомофторовых грибов осуществляют на аналитические
аэрозольные фильтры из перхлорвинила путем фильтрации через них исследуемого
воздуха. Через фильтр пропускают 50 - 600 л воздуха со скоростью 5 - 20 л/мин.
Пробы можно хранить продолжительное время при температуре 2 - 5 °C.
1.6.
Проведение определения
Фильтр с пробой
помещают на предметное стекло (аэрозольными частицами вверх), свисающие части
фильтра отрезают ножницами. Предметное стекло с фильтром помещают в
металлическую кювету над слоем кипящего ацетона (подогревают на водяной бане,
работу проводят в вытяжном шкафу) и накрывают стеклянной крышкой. Под
воздействием паров ацетона происходит просветление фильтра в течение 5 - 15 с.
Предметное стекло извлекают из кюветы, ацетон в течение 10 - 20 с испаряется.
Подсчет спор на
фильтре проводят путем микроскопии в проходящем свете при увеличении 20 x 7 или
20 x 10 в препарате "раздавленная капля". Для этого на просветленный
фильтр наносят на два участка на расстоянии 30 - 35 мм по одной капле дистиллированной
воды и накрывают покровными стеклами. Подсчитывают количество покоящихся спор в
50 полях зрения микроскопа (по 5 x 5 на обоих участках фильтра). Для
равномерного обзора всего участка фильтра споры подсчитывают в полях зрения,
расположенных не подряд, а с интервалами в 2 - 3 поля. Покоящиеся споры энтомофторовых грибов имеют округлую форму и четко
различимую двойную оболочку. В центре споры располагается крупная "жировая
капля". Спора имеет размеры от 27 до 50 мкм (в среднем 33 мкм), а
"жировая капля" - 12 - 20 мкм.
1.7.
Обработка результатов
Концентрацию
покоящихся спор энтомофторовых грибов в воздухе (X,
спор/куб. м) вычисляют по формуле:
S x N x 1000
X = -------------,
S x N x V
1 1
20
где:
S - площадь
аналитического аэрозольного фильтра
(той части, через
которую проходит воздух при
закреплении фильтра в аллонже), кв. мм;
S - площадь поля зрения микроскопа, кв. мм;
1
N -
количество подсчитанных спор энтомофторовых грибов,
ед.;
N - количество просмотренных полей зрения
микроскопа, ед.;
1
V - объем воздуха, отобранный для анализа и
приведенный к стандартным
20
условиям, л;
1000 -
коэффициент пересчета литров в метры кубические.
2.
Требования безопасности
Соблюдаются общие
правила по технике безопасности при работе с легковоспламеняющимися жидкостями
и электроприборами. Выполняются меры предосторожности, обычно рекомендуемые для
работы с микроорганизмами IV группы (условно патогенные), сущность которых
сводится к предупреждению загрязнения проб и соблюдению правил личной гигиены.