Утверждаю
Главный
государственный
санитарный врач
Российской
Федерации -
Первый заместитель
Министра
здравоохранения
Российской
Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
21 декабря 2000
года
Дата введения:
с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ
КЛЕТОК ШТАММА - ПРОДУЦЕНТА БИОВИТА И ХЛОРТЕТРАЦИКЛИНА
STREPTOMYCES AUREFACIENS 777 В
ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1007-00
1. Разработаны к.б.н. Бобровым В.И. (Всероссийский научный
центр биологически активных веществ), д.м.н. Ивановым Н.Г., к.б.н. Шеиной Н.И.
(Российский государственный медицинский университет).
2. Утверждены и
введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской
Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 21
декабря 2000 г.
3. Введены впервые.
1. Общие
положения и область применения
Настоящие
методические указания устанавливают методику проведения микробиологического
количественного анализа концентрации клеток штамма - продуцента Биовита и
хлортетрациклина Streptomyces aurefaciens 777 в воздухе рабочей зоны в
диапазоне концентраций от 100 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические
указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма
Str. aurefaciens 777 в воздухе производственных помещений биотехнологических
производств и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим
нормативам на основе учета требований ГОСТа 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух
рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТа Р 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".
Методические
указания предназначены для центров госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий
биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий
научно-исследовательских институтов, работающих в области промышленной гигиены.
Методические
указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты
биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии
"Научные основы гигиены окружающей среды".
2.
Биологическая характеристика штамма-продуцента
Streptomyces
aurefaciens 777 и его гигиенический норматив
Продуцент Биовита и
хлортетрациклина - Streptomyces aurefaciens 777 относится к актиномицетам, является
облигатным аэробом. Период развития характерных колоний составляет 10 - 12
суток. Оптимальная температура роста - 28 - 30 °С.
На агаризованной
среде СР-12 дает колонии с обильным воздушным мицелием серого цвета, выделяющие
в среду темно-коричневый пигмент. Гифы мицелия утолщены, сильно ветвящиеся.
Колонии плоские, слабоскладчатые с глубоким кратером в центре.
Предельно
допустимая концентрация Streptomyces aurefaciens 777
3
в воздухе
рабочей зоны - 5 х 10
кл./куб. м, пометка А, 3 класс
опасности.
3. Пределы
измерений
Методика
обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента Биовита в
воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 50000 клеток в 1 куб. м
при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод
измерений
Метод измерения
концентрации штамма - продуцента Streptomyces aurefaciens 777 основан на
аспирации аппаратом Кротова микробных клеток (спор, обрывков мицелия) на
поверхность плотной питательной среды СР-12 и подсчете выросших колоний,
которые выявляются при задержке роста тест-культуры
(Bacillus subtilis), происходящего вследствие диффузии в агар антибиотика
хлортетрациклина, выделяемого штаммом - продуцентом Streptomyces aurefaciens
777.
При данном методе
на чашке Петри после забора пробы может быть учтено до 50 колоний, т.к. большее
количество колоний на чашке могут образовывать сливающиеся зоны лизиса, что
приводит к занижению результатов.
5. Средства
измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и
материалы
При выполнении
измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и
материалы.
5.1.
Средства измерений, вспомогательные
устройства,
материалы
Прибор
для бактериологического анализа
ТУ 64-12791-77
воздуха,
модель 818 (щелевой прибор Кротова)
Термостаты
электрические суховоздушные
или
водяные
Автоклав
электрический
ГОСТ 9586-75
Бокс,
оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник
бытовой
Весы
лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп
биологический с иммерсионной
системой
типа "Биолам" Л-211
Водяная
баня или водяной термостат
Газовая
горелка или спиртовка лабораторная
Чашки
Петри
Петли
бактериологические
Пробирки
биологические вместимостью 20 и 35 мл
ГОСТ 10515-75
Пипетки
мерные на 1, 5 и 10 мл
ГОСТ 10515-75
Пипетки
мерные на 1, 5, и 10 мл
ГОСТ 1770-74
Колбы
конические вместимостью 250 и 500 мл
ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр
ГОСТ 24696-79
Марля
медицинская
ГОСТ 9412-77
Вата
медицинская гигроскопическая
ГОСТ 25556-81.
5.2.
Реактивы, растворы
Среда
СР-12, агаризованная питательная среда
для
продуцента Биовита
Агаризованная
среда Хоттингера, рН 6,8 - 7,0
Спирт
этиловый ректификат
ГОСТ 5962-67
Хлороформ
Тетрациклина
гидрохлорид
Амфотерицин В для внутривенного введения.
Тест-культура Вас.
subtilis вариант Л музейный
штамм, споры
2
хранят
в виде водной суспензии при температуре 4 °С.
6.
Требования безопасности
При выполнении измерений
концентрации клеток продуцента Биовита и хлортетрациклина в воздухе рабочей
зоны соблюдают:
- Правила техники
безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТом
12.1.005-88.
- Правила
электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ
12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации приборов.
- Требования,
изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике
безопасности в микробиологической промышленности" (1980).
- Положения
инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе
в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности
(1977).
7.
Требования к квалификации оператора
К выполнению
измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним
специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки
работы в области микробиологических исследований.
8. Условия
измерений
Процессы
приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях
в соответствии с ГОСТом 15150-69 при температуре воздуха 20 +/- 5 °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности
воздуха не более 80%.
9.
Проведение измерения
9.1. Условия отбора
проб воздуха
Для определения
концентрации Streptomyces aurefaciens 777 воздух производственных помещений
аспирируют со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды
СР-12 в чашку Петри, помещенную в аппарат Кротова.
Аппарат Кротова
перед каждым отбором воздуха тщательно протирают спиртом. На подвижной диск
устанавливают чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Крышку
прибора закрывают. После отбора пробы воздуха и остановки диска открывают
крышку прибора, снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. В
период отбора проб воздуха крышку чашки Петри хранят в стерильном пакете из
бумаги, полиэтилена или других стерильных емкостях.
Время аспирации
воздуха (1 - 10 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма -
продуцента в воздухе рабочей зоны.
Отбор проб
сопровождается составлением акта отбора с указанием места, времени и условий
отбора.
9.2. Выполнение
анализа
Агаризованную среду
СР-12 расплавляют и остужают до 50 - 60 °С. Затем добавляют свежеприготовленный
в стерильной дистиллированной воде амфотерицин для инъекций из расчета 20 мкг
на 1 л среды для подавления посторонней воздушной грибковой флоры, тщательно
перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри по 10 мл. Чашки с застывшей
средой помещают в термостат при 37 °С на сутки, после
чего проросшие чашки бракуют.
После отбора проб
воздуха на чашки Петри в аппарате Кротова их помещают в термостат при
температуре 28 - 30 °С на 48 часов.
После инкубации
чашки помещают в вытяжной шкаф. На внутреннюю поверхность наливают 1,5 мл
хлороформа, чашку с посевом вверх донышком вставляют в крышку так, чтобы
выросшие колонии бактерий находились в парах хлороформа не менее 20 - 30 минут.
Затем каждую чашку вынимают из крышки, выливают оставшийся хлороформ, снова
закрывают крышками и переносят в бокс. Чашки оставляют в боксе на 2 часа при
комнатной температуре для преддиффузии.
Затем
чашки Петри заливают 5 мл агаризованной среды Хоттингера
2 7
с тест-культурой Вас. subtilis,
вар. Л из
расчета 3 х 10
споровых клеток
на 1 мл среды (Государственная фармакопея СССР.,
Вып. XI, 1989. 206 с.).
Чашки Петри с
застывшей средой Хоттингера донышком вверх помещают в термостат при 37 °С на сутки. По окончании инкубации, т.е. через 3 суток
после отбора пробы воздуха производят подсчет зон задержки роста тест-культуры, которые соответствуют числу проросших клеток
штамма - продуцента Streptomyces aurefaciens 777. Учитывают зоны диаметром не
менее 5 мм.
10.
Вычисление результатов измерений
Расчет концентрации
микробных клеток Streptomyces aurefaciens 777 в 1 куб. м воздуха производят по
формуле:
П х 1000
Х = --------,
Т х В
где:
Х - количество
микробных клеток в воздухе (1 куб. м);
П - число зон задержки роста тест-культуры, что соответствует числу
колоний, выросших на чашке Петри;
Т - время забора
пробы воздуха, мин.;
В - скорость подачи
воздуха, л/мин.;
1000 - коэффициент
перевода 1 л в 1 куб. м.
11.
Оформление результатов измерений
Результаты
измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N ____
количественного
микробиологического анализа
штамма - продуцента
Streptomyces aurefaciens 777
в воздухе рабочей
зоны
1. Дата
проведения анализа ___________________________________
2. Место
отбора пробы ________________________________________
3.
Название лаборатории ______________________________________
4.
Юридический адрес организации _____________________________
Результаты
микробиологического анализа
|
Шифр
или N пробы
|
Определяемый
микроорганизм
|
Концентрация,
кл/куб. м
|
|
|
|
|
Ответственный
исполнитель
Научный
руководитель
Список
литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88
"ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования".
2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".
3. Положение об
организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности.
М., 1980. 27 с.
4. Инструкции по
устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в
микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности.
М., 1977. 7 с.
5. Государственная
фармакопея СССР., 1989. Вып. XI. 206 с.