Утверждаю
Главный
государственный
санитарный врач
Российской
Федерации -
Первый заместитель
Министра
здравоохранения
Российской
Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
21 декабря 2000
года
Дата введения:
с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ
КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМА PSEUDOMONAS
FLUORESCENS (DENITRIFICANS) В 99 - ПРОДУЦЕНТА
ВИТАМИНА В12 В ВОЗДУХЕ
РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1008-00
1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской
Л.В. (Государственный научный центр по антибиотикам).
2. Утверждены и
введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской
Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 21
декабря 2000 г.
3. Введены впервые.
1. Общие
положения и область применения
Настоящие методические указания
устанавливают методику
проведения
микробиологического
количественного анализа
концентрации клеток штамма Pseudomonas
fluorescens (denitrificans)
В 99 -
продуцента витамина В
в воздухе рабочей зоны в диапазоне
12
концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м
воздуха.
Методические
указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.005-88
"ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования"
и ГОСТа Р 8.563-96 "Методики выполнения
измерений".
Методические
указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и
учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
Методические
указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты
биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной
комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".
2.
Характеристика штамма - продуцента витамина В
12
Микроорганизм Pseudomonas
fluorescens
(denitrificans) В 99
является
продуцентом витамина В . Штамм растет на агаризованных
12
средах на
основе мелассы при
температуре 28 °С. В течение 3-х
суток
образует округлые колонии
1 - 2
мм белого цвета.
Морфологически
представляет собой грамотрицательные подвижные
палочки размером 0,45 - 0,85 х 0,6 мкм. Штамм
устойчив к следующим
антибиотикам:
левомицетину, линкомицину, полимиксину М,
ристомицину, цефалотину и эритромицину.
Предельно
допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл./куб.
м.
3. Пределы
измерений
Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток
продуцента
витамина В в воздухе
рабочей зоны в
диапазоне
12
концентраций
от 100 до
3000 клеток в
1 куб. м воздуха при
доверительной вероятности 0,95.
4. Метод
измерений
Метод основан
на аспирации из
воздуха клеток продуцента
витамина В и на поверхность плотной питательной среды и
подсчете
12
выросших колоний по типичным морфологическим
признакам.
5. Средства
измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и
материалы
При выполнении
измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и
материалы.
5.1.
Средства измерений, вспомогательные
устройства,
материалы
Прибор
для бактериологического анализа воздуха,
ТУ 64-12791-77
модель
818 (щелевой прибор Кротова)
Термостаты
электрические суховоздушные
или
водяные
Автоклав
электрический
ГОСТ 9586-75
Бокс,
оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник
бытовой
Весы
лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп
биологический с иммерсионной
системой
типа "Биолам" Л-211
Лупа
с увеличением х 10
ГОСТ 25706-83
Чашки
Петри бактериологические плоскодонные
стеклянные
диаметром 100 мм
Пробирки
биологические вместимостью 20 и 35 мл
ГОСТ 10515-75
Пипетки
мерные на 1, 5 и 10 мл
ГОСТ 10515-75
Пипетки
мерные на 1, 5 и 10 мл
ГОСТ 1770-74
Колбы
конические вместимостью 250 и 500 мл
ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ
9586-75
Барометр
ГОСТ 24696-79
Марля
медицинская
ГОСТ 9412-77
Вата
медицинская гигроскопическая
ГОСТ 25556-81.
5.2.
Реактивы, растворы
Антибиотики:
левомицетин, линкомицин, полимиксин
М, цефалотин, эритромицин.
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Селективная среда для штамма-продуцента.
Среда:
меласса - 100 - 150 г; (NH ) HPO - 1,3 г; MgSO 7H
O -
4 2 4 4
2
1,0 г; (NH ) SO - 0,5 г; MnSO H O -
0,1 г; ZnSO 7H O
- 0,1 г;
4
2 4 4 2 4 2
агар Difco
- 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл;
рН - 6,8 -
7,0; стерилизация - 121 °С,
30 минут.
6.
Требования безопасности
При выполнении
измерений концентрации клеток
продуцента
витамина В
в
воздухе рабочей зоны
соблюдают следующие
12
требования.
6.1. Правила
техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.2.
Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и
инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. Руководство
"Положение об организации работы по технике безопасности в
микробиологической промышленности" (1980), "Инструкции по устройству,
требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических
лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).
6.4. Все виды работ
с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа
с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными
лампами.
7.
Требования к квалификации операторов
К выполнению
измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним
специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки
работы в области микробиологических исследований.
8. Условия
измерений
Процессы
приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных
условиях при температуре воздуха 20 +/- 5 °С,
атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.
9.
Проведение измерения
9.1.
Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента витамина В воздух аспирируют при
12
помощи
аппарата Кротова со
скоростью 10 л/мин. на поверхность
плотной
питательной среды. Время
аспирации воздуха (1 - 10 мин.)
зависит от предполагаемой концентрации клеток
продуцента.
Аппарат Кротова
перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно
тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку
прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают
подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор
закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора
пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и
закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают
точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2.
Выполнение анализа
Метод предполагает
учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2 -
3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200
колоний продуцента.
Селективную среду
расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют
свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика
(левомицетин, линкомицин, цефалотин
и др.) из расчета 30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней
бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в
стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой
помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С,
после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля
воздуха.
После отбора проб
воздуха чашки Петри помещают в термостат при 28 °С. Через 48 - 72 часа
производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости
культуру подвергают микроскопированию.
10.
Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации
клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:
N 1000
Х = ------, кл./куб. м,
V
где:
Х - концентрация
клеток продуцента в воздухе;
N - количество
колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент
пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
В случае
невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод
седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с
плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60
минут (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе). При
использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток
продуцента:
эмпирически
установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см оседает количество бактерий,
содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин. - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри
диаметром 100 мм (радиус 8 см) равна 78,54 кв. см.
Составляем
пропорцию:
на 100 кв. см за 1
мин. оседает 2 л воздуха
на 78,54 кв. см - Х
л
Х = 1,57 л/мин.
Следовательно, на
стеклянную чашку Петри за 1 мин. оседает 1,57 л воздуха.
Надо определить
количество клеток в 1 куб. м воздуха.
На 1 чашку (диаметр
100 мм) за 1 мин. оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха,
за Т мин. - 1,57 х Тл.
В этом количестве
содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков
мицелия), а в 1 куб. м воздуха содержится:
N х 1000 N х 636,9
-------- = ---------.
1,57 х
Т Т
Пример: за 30
мин. седиментации выросло
12 колоний
микроорганизма. В 1 куб. м воздуха содержится:
12 х 636,9
---------- = 253 клетки.
30
11.
Оформление результатов измерений
Результаты
измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N
Количественного микробиологического анализа
штамма - продуцента Pseudomonas fluorescens
(denitrificans) В 99 в воздухе рабочей зоны
Дата
проведения анализа ______________________________________
Место
отбора пробы ___________________________________________
Название
лаборатории _________________________________________
Юридический адрес организации ________________________________
Результаты микробиологического анализа
|
Шифр
или N пробы
|
Определяемый
микроорганизм
|
Концентрация,
кл/куб. м
|
|
|
|
|
Ответственный исполнитель
Научный
руководитель
Список
литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88
"ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования".
2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".
3. Положение об
организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности,
М., 1980. 27 с.
4. Инструкции по
устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в
микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности,
М., 1977. 7 с.