Утверждаю
Главный
государственный
санитарный врач
Российской
Федерации,
Первый заместитель
Министра
здравоохранения
Российской
Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
20 сентября 2001
года
Дата введения:
с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ
КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМА STREPTOMYCES CINNAMONENSIS
НИЦБ 109 - ПРОДУЦЕНТА МОНЕНЗИНА В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1067-01
1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской
А.В. (Государственный научный центр по антибиотикам).
2. Утверждены и
введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской
Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации
20 сентября 2001 г.
3. Введены впервые.
1. Общие
положения и область применения
Настоящие
методические указания устанавливают методику проведения
микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Streptomyces cinnamonensis НИЦБ
109 - продуцента монензина в воздухе рабочей зоны в
диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические
указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ.
Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".
Методические
указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и
учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
2. Характеристика штамма-продуцента монензина
Микроорганизм Streptomyces cinnamonensis НИЦБ
109 является продуцентом антибиотика монензина. Штамм
растет на различных агаризованных и жидких средах.
Культура образует цепочки спор, обычно прямые или слегка извилистые, с гладкой
оболочкой.
На твердой
питательной среде ISP
на 3 сутки
роста при
температуре
28 °С образует
округлые радиально-складчатые
морщинистые
колонии с кремовым или сероватым налетом, фестончатым
краем и выпуклым
более темным центром
диаметром 1 - 2 мм. На
шестые
сутки инкубации размеры
колонии достигают 3
- 5 мм,
конфигурация
и складчатость колоний
не изменяется, образуется
воздушный
мицелий со спорами
бежевато-серого цвета,
в среду
выделяет
коричневый пигмент. Штамм
устойчив к следующим
антибиотикам:
левомицетину (30 мкг/мл), линкомицину (15 мкг/мл),
полимиксину М (100 мкг/мл), эритромицину (мкг/мл),
тетрациклину
(30
мкг/мл) и олеандомицину (15
мкг/мл). ПДК -
3000
р.з.
кл./куб. м.
3. Пределы
измерений
Методика
обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента монензина в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций
от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод
измерений
Метод основан на
аспирации из воздуха клеток продуцента монензина на
поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным
морфологическим признакам.
5. Средства
измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и
материалы
При выполнении
измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и
материалы.
5.1.
Средства измерений,
вспомогательные
устройства, материалы
Прибор
для бактериологического анализа
воздуха,
модель 818 (щелевой прибор Кротова)
ТУ 64-12791 77
Термостаты
электрические суховоздушные или
водяные
Автоклав
электрический
ГОСТ 9586-75
Бокс,
оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник
бытовой
Весы
лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп
биологический с иммерсионной
системой
типа "Биолам" Л-211
Лупа
с увеличением х10
ГОСТ 25706-83
Чашки
Петри бактериологические плоскодонные
стеклянные
диаметром 100 мм
Пробирки
биологические вместимостью 20 и 35 мл
ГОСТ 10515-75
Пипетки
мерные на 1,5 и 10 мл
ГОСТ 10515-75
Пипетки
мерные на 1,5, и 10 мл
ГОСТ 1770-74
Колбы
конические вместимостью 250 и 500 мл
ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ
9586-75
Барометр ГОСТ
24696-79
Марля
медицинская
ГОСТ 9412-77
Вата
медицинская гигроскопическая
ГОСТ 25556-81.
5.2.
Реактивы, растворы
Антибиотики:
левомицетин, линкомицин,
полимиксин М, эритромицин, тетрациклин,
олеандомицин и нистатин
Спирт
этиловый ректификат
ГОСТ 5962-67
Селективная
среда для штамма-продуцента
Среда
ISP: Мальт-экстракт (Difco)
- 1,5%,
дрожжевой
экстракт (Difco) - 0,5%, крахмал
растворимый
- 0,5%, мел химический осажденный
-
0,3%, Бакто-агар (Difco) -
2,0%, вода
дистиллированная - 100 мл, рН 7,2 - 7,4.
6.
Требования безопасности
При выполнении
измерений концентрации клеток продуцента монензина в
воздухе рабочей зоны соблюдают:
- правила техники
безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
- правила
электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и
инструкцию по эксплуатации прибора;
- положения
"Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при
работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической
промышленности" (1977).
Все виды работ с
реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с
биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными
лампами.
7.
Требования к квалификации операторов
К выполнению
измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним
специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки
работы в области микробиологических исследований.
8. Условия
измерений
Процессы
приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных
условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности
воздуха не более 80%.
9.
Проведение измерений
9.1.
Условия отбора проб воздуха
Для определения
продуцента монензина воздух аспирируют
при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной
питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин.) зависит от
предполагаемой концентрации клеток продуцента.
Аппарат Кротова
перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно
тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку
прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают
подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор
закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора
пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и
закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают
точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2.
Выполнение анализа
Метод предполагает
учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3 -
6-е сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до
200 колоний продуцента.
Селективную среду
расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют
свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор одного из
антибиотиков (левомицетин, линкомицин, цефалотин или другой, указанные в разделе 2) для подавления
посторонней бактериальной микрофлоры и нистатина (10
мкг/мл) для подавления грибковой флоры, тщательно перемешивают и разливают по
10 - 15 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с
застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки
используют для контроля воздуха.
После отбора проб
воздуха чашки Петри помещают в термостат при 28 °С. Через 72
ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При
необходимости культуру подвергают микроскопированию.
10.
Вычисление результатов измерений
Расчет концентрации
клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:
N х 1000
X = --------, кл./куб. м,
V
где:
X - концентрация
клеток продуцента в воздухе;
N - количество
колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент
пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
В случае
невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод
седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с
плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60
мин. При этом пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:
эмпирически
установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см оседает количество бактерий,
содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри
диаметром 100 мм равна 78,54 кв. см.
Составляем
пропорцию:
на 100 кв. см за 1 мин. оседает 2 л воздуха
на 78,54 кв. см - Х л.
Х = 1,57 л/мин.
Следовательно, на
стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает количество бактерий, содержащееся в
1,57 л воздуха.
Надо определить
количество клеток в 1 куб. м воздуха. На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин.
оседает количество микробов, содержащееся в 1,57 л воздуха, за Т мин. - 1,57 х Тл.
В этом количестве
содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков
мицелия), а в 1 куб. м воздуха содержится:
N х 1000 N х 636,9
-------- = ---------.
1,57 х T T
Пример: за 30 мин.
седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 куб. м воздуха содержится:
12 х 636,9
---------- = 253
клетки.
30
11.
Оформление результатов измерений
Результаты
измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N _____
количественного
микробиологического анализа штамма
Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 - продуцента монензина
в воздухе рабочей
зоны
Дата проведения
анализа ________________________________
Место отбора пробы
_____________________________________
Название
лаборатории ___________________________________
Юридический адрес
организации __________________________
Результаты
микробиологического анализа
|
Шифр или N пробы
|
Определяемый
микроорганизм
|
Концентрация,
кл./куб. м
|
|
|
|
|
Ответственный
исполнитель
Научный
руководитель
Список
литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88
"ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования".
2. ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".
3. Положение об
организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности
(М., 1980, 27 с.).
4. Инструкции по
устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в
микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности
(М., 1977, 7 с.).