Утверждаю
Главный
государственный
санитарный врач
Российской
Федерации,
Первый заместитель
Министра
здравоохранения
Российской
Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
20 сентября 2001
года
Дата введения:
с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ
КЛЕТОК
ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ТИЛОЗИНА STREPTOMYCES FRADIAE БС-1
В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.1068-01
1. Разработаны д.м.н. Ивановым Н.Г., к.б.н. Шенной Н.И.
(Российский государственный медицинский университет).
2. Утверждены и
введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской
Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации
20 сентября 2001 г.
3. Введены впервые.
1. Общие
положения и область применения
Настоящие
методические указания устанавливают методику проведения
микробиологического количественного анализа концентрации клеток
штамма-продуцента тилозина Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей
зоны в диапазоне концентраций от 100 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические
указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма
Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе производственных помещений
биотехнологических производств и оценки соответствия уровня его содержания
гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 12.1.005-88
"ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования"
и ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения
измерений".
Методические
указания предназначены для центров госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий
биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий
научно-исследовательских институтов, работающих в области промышленной гигиены.
2.
Биологическая характеристика штамма-продуцента
Streptomyces
fradiae БС-1 и его гигиенический норматив
Систематическое
положение штамма-продуцента
Порядок
Actinomycetales
Класс
Actinomycetes
Семейство
Streptomycetaceae
Род
Streptomyces
Вид
fradiae
Штамм
БС-1
Культурально-морфологические
особенности штамма
Штамм Streptomyces
fradiae БС-1 является облигатным аэробом, растет на различных питательных
средах: СР-6, СР-15, Гаузе-1, Ваксмана путем инкубирования в термостате при
температуре 28 °С. Продолжительность развития составляет 10 - 15 суток.
Четкие культурально-морфологические
свойства штамма проявляются на агаризованной среде СР-15 на 3 день развития. На
этой среде штамм образует 6 морфологических типов колоний, из которых наиболее
характерный тип составляет более 70%. Изучаемый штамм представлен округлыми колониями
до 9 мм в диаметре (в зависимости от плотности посева). Белый воздушный мицелий
образуется в центре колонии и по периферии в виде одной, реже двух
концентрических окружностей, край колоний не опушен. Профиль изогнутый,
поверхность шероховатая, неопушенные части колоний гладкие, блестящие,
кремовые. Структура мелкозернистая, по краю неопушенной части однородная.
Консистенция плотная, пигмент с обратной стороны колоний желтовато-коричневый.
Предельно
допустимая концентрация Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны - 2000
кл/куб. м, пометка А, 3 класс опасности.
3. Пределы
измерений
Методика
обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента тилозина в
воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 50000 клеток в 1 куб. м
при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод
измерений
Метод измерения
концентрации штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1 основан на аспирации
аппаратом Кротова микробных клеток (спор, обрывков мицелия) на поверхность
плотной питательной среды СР-15 и подсчете выросших колоний, которые выявляются
при задержке роста тест-культуры (Bacillus subtilis),
происходящего вследствие диффузии в агар антибиотика, выделяемого
штаммом-продуцентом Streptomyces fradiae БС-1.
При данном методе
на чашке Петри после забора пробы может быть учтено до 50 колоний, т.к. большее
количество колоний на чашке могут образовывать сливающиеся зоны лизиса, что
приводит к занижению результатов.
5. Средства
измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и
материалы
При выполнении
измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и
материалы.
5.1.
Средства измерений, вспомогательные
устройства,
материалы
Прибор
для бактериологического анализа воздуха,
модель
818 (щелевой прибор Кротова)
ТУ 64-12791-77
Термостаты
электрические суховоздушные
или
водяные
Автоклав
электрический
ГОСТ 9586-75
Бокс,
оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник
бытовой
Весы
лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп
биологический с иммерсионной
системой
типа "Биолам" Л-211
Водяная
баня или водяной термостат
Газовая
горелка или спиртовка лабораторная
Чашки
Петри
Петли
бактериологические
Пробирки
биологические вместимостью 20 и 35 мл
ГОСТ 10515-75
Пипетки
мерные на 1, 5 и 10 мл
ГОСТ 10515-75
Пипетки
мерные на 1, 5 и 10 мл
ГОСТ 1770-74
Колбы
конические вместимостью 250 и 500 мл
ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ
24696-79
Марля
медицинская
ГОСТ 9412-77
Вата
медицинская гигроскопическая
ГОСТ 25556-81.
5.2.
Реактивы, растворы
Среда
СР-15, агаризованная питательная
среда для продуцента тилозина (состав в %:
меласса
- 0,5, крахмал - 0,5, соевая мука - 0,5,
кукурузный
экстракт - 0,5, (NH ) SO - 0,1,
4 2 4
NaCl
- 0,1, MgSO х 7H O - 0,05, СаСО - 0,2,
4 2 3
агар
- 1,5; рН среды до стерилизации 7,0 - 7,2;
режим
стерилизации 1,1 - 1,2 атм., 40 - 50 мин.)
Агаризованная
среда Хоттингера, рН 6,8 - 7,0
Спирт
этиловый ректификат
ГОСТ 5962-67
Хлороформ
Тетрациклина
гидрохлорид
Амфотерицин В для внутривенного введения
Тест-культура
Вас. subtilis вариант Л - музейный
2
штамм,
споры хранят в виде водной суспензии при
температуре
4 °С.
6.
Требования безопасности
При выполнении
измерений концентрации клеток продуцента Биовита и хлортетрациклина в воздухе
рабочей зоны соблюдают:
- правила техники
безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ
12.1.005-88;
- правила
электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ
12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации приборов;
- требования,
изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике
безопасности в микробиологической промышленности" (1980);
- положения
"Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при
работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической
промышленности" (1977).
7.
Требования к квалификации оператора
К выполнению
измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним
специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки
работы в области микробиологических исследований.
8. Условия
измерений
Процессы
приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных
условиях в соответствии с ГОСТ 15150-69 при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 630 - 800
мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.
9.
Проведение измерений
9.1.
Условия отбора проб воздуха
Для определения
концентрации Streptomyces fradiae БС-1 воздух производственных помещений
аспирируют со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды
СР-15 в чашку Петри, помещенную в аппарат Кротова.
Аппарат Кротова
перед каждым отбором воздуха тщательно протирают спиртом. На подвижный диск
устанавливают чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Крышку
прибора закрывают. После отбора пробы воздуха и остановки диска открывают
крышку прибора, снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. В период
отбора проб воздуха крышку чашки Петри хранят в стерильном пакете из бумаги,
полиэтилена или других стерильных емкостях.
Время аспирации
воздуха (1 - 10 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток
штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны.
Отбор проб
сопровождается составлением акта отбора с указанием места, времени и условий
отбора.
9.2.
Выполнение анализа
Агаризованную среду
СР-15 расплавляют и остужают до 50 - 60 °С. Затем добавляют свежеприготовленный
в стерильной дистиллированной воде амфотерицин для инъекций из расчета 20 мкг
на 1 л среды для подавления посторонней воздушной грибковой флоры, тщательно перемешивают
и разливают в стерильные чашки Петри по 10 мл. Чашки с застывшей средой
помещают в термостат при 37 °С на сутки, после чего
проросшие чашки бракуют.
После отбора проб
воздуха на чашки Петри в аппарате Кротова их помещают в термостат при температуре
28 - 30 °С на 48 ч.
После инкубации
чашки помещают в вытяжной шкаф. На внутреннюю поверхность наливают 1,5 мл
хлороформа, чашку с посевом вверх донышком вставляют в крышку так, чтобы
выросшие колонии бактерий находились в парах хлороформа не менее 20 - 30 мин.
Затем каждую чашку вынимают из крышки, выливают оставшийся хлороформ, снова
закрывают крышками и переносят в бокс. Чашки оставляют в боксе на 2 ч при
комнатной температуре для преддиффузии.
Затем
чашки Петри заливают 5 мл агаризованной среды Хоттингера
7
с тест-культурой
Вас. subtilis вариант
Л из расчета 3 х 10
2
споровых клеток
на 1 мл среды (Государственная
фармакопея СССР,
изд. XI, 1989, с. 206).
Чашки Петри с
застывшей средой Хоттингера донышком вверх помещают в термостат при 37 °С на сутки. По окончании инкубации, т.е. через 3 суток
после отбора пробы воздуха производят подсчет зон задержки роста тест-культуры, которые соответствуют числу проросших клеток
штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1. Учитывают зоны диаметром не менее
5 мм.
10.
Вычисление результатов измерений
Расчет концентрации
микробных клеток Streptomyces fradiae БС-1 в 1 куб. м воздуха производят по формуле:
П
х 1000
Х = --------,
Т х В
где:
Х - количество
микробных клеток в воздухе (1 куб. м);
П - число зон задержки роста тест-культуры, что соответствует числу
колоний, выросших на чашке Петри;
Т - время забора
пробы воздуха, мин.;
В - скорость подачи
воздуха, л/мин.;
1000 - коэффициент
перевода 1 л в 1 куб. м.
11.
Оформление результатов измерений
Результаты
измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N ____
количественного
микробиологического анализа
штамма-продуцента
Streptomyces fradiae БС-1
в воздухе рабочей
зоны
Дата проведения
анализа ______________________________
Место отбора пробы
___________________________________
Название
лаборатории _________________________________
Юридический адрес
организации ________________________
Результаты
микробиологического анализа
|
Шифр
или N пробы
|
Определяемый
микроорганизм
|
Концентрация,
кл./куб. м
|
|
|
|
|
Ответственный
исполнитель
Научный
руководитель
Список
литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88
"ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования".
2. ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".
3. Положение об
организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности
(М., 1980, 27 с.).
4. Инструкции по
устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в
микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности
(М., 1977, 7 с.).
5. Государственная
фармакопея СССР, 1989, изд. XI, с. 206.