Утверждаю
Главный
государственный
санитарный врач
Российской
Федерации,
Первый заместитель
Министра
здравоохранения
Российской
Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
18 декабря 2003
года
Дата введения:
1 апреля 2004 года
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИЙ ФЛУАЗИНАМА В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ
ЗОНЫ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.1825-03
1. Методические
указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана
(проф. Т.В. Юдина), Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева
(проф. В.А. Калинин) при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава
России (гл. специалист А.П. Веселов), под редакцией член-корр. РАМН В.В.
Ракитского.
2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по
государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве
России (прот. N 20 от 2 декабря 2003 г.).
3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным
врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения
Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 18 декабря 2003 г.
4. Введены впервые.
Настоящие
методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной
хроматографии для определения в воздухе рабочей зоны массовой концентрации
флуазинама в диапазонах 0,1 - 1,0 мг/куб. м.
Флуазинам -
действующее вещество препарата Ширлан, СК (500 г/л);
фирма-производитель
- ИСК БИОСАЙЕНСИС (Бельгия).
3-хлор-N-(3-хлор-5-тирфторметил-2-пиридил)-альфа,альфа,альфа-трифтор-2,6-динитро-р-толуидин (IUPAC).
Структурная формула
(не приводится).
C H Cl F N O .
13 4 2 6 4 4
Мол. масса 465,1.
Светло-желтое
кристаллическое вещество. Температура плавления 115 - 117 °С. Давление паров
при 25 °С: 1,5 мПа. Растворимость в органических растворителях при 20 °С (г/л): ацетон - 470; гексан - 12; дихлорметан - 330;
диэтиловый эфир - 320; толуол - 410; этанол - 150. Растворимость в воде при 25 °С - 1,7 мг/л. Вещество стабильно в кислой и щелочной средах,
а также при нагревании.
Агрегатное
состояние в воздухе рабочей зоны - пары и аэрозоль.
Краткая
токсикологическая характеристика:
Острая пероральная
токсичность (LD ) для крыс > 5000 мг/кг;
50
острая дермальная токсичность (LD ) для крыс > 2000 мг/кг; острая
50
ингаляционная
токсичность (LK ) для
крыс - 0,463 мг/куб. дм.
50
Область применения
препарата
Флуазинам -
фунгицид защитного действия, обладает слабой системной активностью,
используется в качестве средства борьбы с возбудителями фитофтороза и
альтернариоза картофеля, эффективен против возбудителей серой гнили на
винограде, парши на яблоне, килы на крестоцветных.
Ориентировочно
безопасный уровень воздействия (ОБУВ) в воздухе рабочей зоны - 1,0 мг/куб. м.
1.
Погрешность измерений
Методика
обеспечивает выполнение измерений с погрешностью (дельта), не превышающей +/-
25%, при доверительной вероятности 0,95.
2. Метод
измерения
Измерения
концентраций флуазинама выполняют методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с ультрафиолетовым детектором.
Концентрирование
флуазинама из воздуха осуществляют на последовательно соединенные бумажные
фильтры "синяя лента" и фильтры из пенополиуретана, экстракцию с
фильтров проводят ацетоном.
Нижний предел
измерения в анализируемом объеме пробы - 2 нг.
Определению не
мешают компоненты препаративной формы.
3. Средства
измерений,
вспомогательные
устройства, реактивы и материалы
3.1.
Средства измерений
Жидкостной хроматограф с Номер Госреестра 15945-97
ультрафиолетовым
детектором с
переменной
длиной волны
(фирмы
Perkin-Elmer, США)
Весы
аналитические ВЛА-200 ГОСТ
24104
Пробоотборное
устройство ОП-442ТЦ ТУ
25-11-1414-78
(ЗАО
"ОПТЭК", г. Санкт-Петербург)
или
аспирационное устройство ЭА-1
Барометр-анероид
М-67 ТУ 2504-1797-75
Термометр
лабораторный шкальный ТЛ-2, ТУ 215-73Е
цена
деления 1 °С, пределы измерения
0
- 55 °С
Колбы
мерные вместимостью 100 и ГОСТ
1770
1000
куб. см
Пипетки градуированные 2-го класса ГОСТ 29227
точности
вместимостью 1,0; 2,0; 5,0;
10
куб. см
Пробирки градуированные вместимостью ГОСТ 1770
5
или 10 куб. см
Цилиндры
мерные 2-го класса точности ГОСТ 1770
вместимостью
50 и 500 куб. см.
Допускается
использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2.
Реактивы
Флуазинам
с содержанием действующего вещества
не
менее 97,8% (Бельгия)
Ацетон
ГОСТ 2603
Ацетонитрил
для хроматографии, хч ТУ
6-09-4326-76
Вода
бидистиллированная, деионизованная или
перегнанная
над KMnO
4
Кислота
уксусная
Этиловый
спирт
ГОСТ Р 51652.
Допускается
использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой
квалификацией.
3.3.
Вспомогательные устройства, материалы
Бумажные
фильтры "синяя лента"
ТУ 6-09-2678-77
обеззоленные
Воронки
конусные диаметром ГОСТ
25336
30
- 37 и 60 мм
Груша
резиновая
Колбы
грушевидные на шлифе вместимостью ГОСТ
10394
100
куб. см
Колбы
круглодонные на шлифе вместимостью ГОСТ
9737
250
куб. см
Мембранные
фильтры капроновые
диаметром
47 мм
Насос
водоструйный ГОСТ
10696
Пенополиуретан
ППУ ТУ
2254-153-04691277-95
Пробирки
центрифужные ГОСТ
25336
Ротационный
вакуумный испаритель ИР-1М ТУ
25-11-917-74
или
ротационный вакуумный испаритель
В-169
фирмы Buchi, Швейцария
Стаканы
химические вместимостью ГОСТ
25336
100
куб. см
Стекловата
Стеклянные
палочки
Установка
для перегонки растворителей
Набор
для фильтрации растворителей
через
мембрану
Холодильник
водяной обратный ГОСТ 9737
Хроматографическая
колонка стальная
длиной
25 см, внутренним диаметром
4,0
мм, содержащая Кромасил 100
С18,
зернением 7 мкм
Шприц
для ввода образцов для жидкостного
хроматографа
вместимостью 50 - 100 куб. мм.
Допускается
применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или
лучшими техническими характеристиками.
4.
Требования безопасности
4.1. При работе с
реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с
токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.
4.2. При выполнении
измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила
электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкцией по
эксплуатации прибора.
5.
Требования к квалификации операторов
К выполнению
измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже
лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.
6. Условия
измерений
При выполнении
измерений соблюдают следующие условия:
- процессы
приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре
воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение
измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных
технической документацией к прибору.
7.
Подготовка к выполнению измерений
Перед выполнением
измерений проводят очистку ацетонитрила (при необходимости), подготовку
подвижной фазы для ВЭЖХ, приготовление растворов, фильтров из пенополиуретана,
кондиционирование хроматографических колонок, установление градуировочной
характеристики, отбор проб.
7.1.
Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил кипятят
с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего
перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют
над прокаленным карбонатом калия.
7.2. Очистка
ацетона
Растворитель сушат
над молекулярными ситами 4А и подвергают фракционной перегонке на
ректификационной колонне, целиком собранной из стекла с числом теоретических
тарелок не менее 30. Сосуд для перегонки погружают в водяную баню и через
приемник пропускают медленно струю сухого азота. Затем температуру водяной бани
повышают до 70 - 75 °С и прибор промывают парами
ацетона, после чего холодильник заполняют водой. До начала отбора главной
фракции приемник несколько раз промывают дистиллятом. Перегонку продолжают до
тех пор, пока в сосуде для перегонки не останется приблизительно 100 куб. см
ацетона. Температуру водяной бани следует снижать по мере уменьшения объема
ацетона, во всех случаях она не должна превышать температуру кипения ацетона
более чем на 20°.
7.3. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ
В мерную колбу
вместимостью 1000 куб. см помещают 4,0 куб. см уксусной кислоты, добавляют 800
куб. см ацетонитрила, доводят до метки бидистиллированной водой, перемешивают,
фильтруют и дегазируют.
7.4.
Кондиционирование хроматографической колонки
Промывают колонку
подвижной фазой (п. 7.2) в течение 30 минут при скорости подачи растворителя
1,0 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.
7.5.
Приготовление градуировочных растворов
7.5.1.
Исходный раствор флуазинама для градуировки (концентрация 1 мг/куб. см)
В мерную колбу
вместимостью 100 куб. см помещают 0,1 г флуазинама, доводят до метки метанолом,
тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.
Растворы N 1 - 5
готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного
стандартного раствора.
7.5.2.
Раствор N 1 флуазинама для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см)
В мерную колбу
вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см исходного стандартного раствора
флуазинама с концентрацией 1 мг/куб. см (п. 7.4.1), разбавляют метанолом до
метки. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.
7.5.3. Рабочие
растворы N 2 - 5 флуазинама для градуировки (концентрация 0,1 - 1,0 мкг/куб.
см)
В 4 мерные
колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,5; 5,0 и 10,0 куб. см
стандартного раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), доводят до
метки подвижной фазой (подготовленной по п. 7.2), тщательно перемешивают,
получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией флуазинама 0,14 0,254 0,5 и
1,0 мкг/куб. см соответственно.
Растворы хранятся в
холодильнике в течение недели.
7.6.
Приготовление фильтров из пенополиуретана
для отбора проб
воздуха
Из пенополиуретана
вырезают фильтр толщиной 2 - 2,5 мм, диаметром 48 - 50 мм, соответствующим
внутреннему диаметру фильтродержателя. Фильтр 3 раза промывают ацетоном
порциями 25 - 30 куб. см на воронке Бюхнера, сушат с помощью разряжения,
создаваемого водоструйным насосом, затем на воздухе при комнатной температуре.
7.7. Отбор
проб
Отбор проб воздуха
проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие
санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".
В течение
15 минут последовательно отбирают 3 пробы, для чего воздух аспирируют в течение
5 минут с объемным расходом 1 - 5 куб. дм/мин. через последовательно
соединенные фильтр "синяя лента" и фильтр из пенополиуретана,
помещенные в фильтродержатель.
Для измерения
концентрации флуазинама на уровне 0,5 ОБУВ воздуха рабочей зоны необходимо
отобрать 1 куб. дм воздуха. Срок хранения отобранных проб, помещенных в
полиэтиленовые пакеты, в холодильной камере при +4 °С
- 5 дней.
7.8.
Установление градуировочной характеристики
Градуировочную
характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от
концентрации флуазинама в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом
абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки N 2 - 5.
В инжектор
хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют
в условиях хроматографирования по п. 7.8.1. Осуществляют не менее 3-х
параллельных измерений. Устанавливают площадь пика флуазинама.
7.8.1.
Условия хроматографирования
Измерения выполняют
при следующих режимных параметрах:
Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором Perkin-Elmer (США).
Колонка стальная
длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Кромасил 100 С18
зернением 7 мкм.
Температура
колонки: комнатная.
Подвижная фаза:
ацетонитрил - вода - уксусная кислота (80:20:0,4, по объему).
Скорость потока
элюента: 1,0 куб. см/мин.
Рабочая длина
волны: 258 нм.
Чувствительность:
0,01 ед. абсорбции на шкалу.
Объем вводимой
пробы: 20 куб. мм.
Ориентировочное
время выхода флуазинама: 5,9 - 6,1 мин.
Линейный диапазон
детектирования: 2 - 20 нг.
Образцы, дающие
пики большие, чем стандартный раствор флуазинама с концентрацией 1,0 мкг/куб.
см, разбавляют подвижной фазой (подготовленной по п. 7.3).
Градуировочный
график проверяют ежедневно по анализу 2-х стандартных растворов различной
концентрации. Если значения площади отличаются более чем на 6% от данных,
заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя
свежеприготовленные рабочие стандартные растворы.
8.
Выполнение измерений
Фильтры с
отобранной пробой переносят в химический стакан вместимостью 100 куб. см,
заливают 10 куб. см ацетона, помещают на встряхиватель на 10 минут.
Растворитель сливают, фильтр еще дважды обрабатывают новыми порциями ацетона
объемом 10 куб. см.
Объединенный
экстракт упаривают в грушевидной колбе на ротационном вакуумном испарителе при
температуре бани не выше 35 °С почти досуха,
оставшийся растворитель отдувают потоком теплого воздуха, остаток растворяют в
5 куб. см подвижной фазы (подготовленной по п. 7.3) и анализируют при условиях
хроматографирования, указанных в п. 7.8.1.
Пробу вводят в
инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площадь пика, с помощью
градуировочного графика определяют концентрацию флуазинама в хроматографируемом
растворе.
Перед анализом
опытной пробы проводят хроматографирование холостой (контрольной) пробы -
экстракта неэкспонированного фильтра.
9.
Обработка результатов измерений
Массовую концентрацию флуазинама
в пробе воздуха рабочей зоны
Х, мг/куб. м, рассчитывают по формуле:
Х = С х W / V ,
20
где:
С - концентрация
флуазинама в хроматографируемом растворе,
найденная по
градуировочному графику в
соответствии с величиной
площади хроматографического пика, мкг/куб. см;
W - объем экстракта, подготовленного для
хроматографирования,
куб. см;
V - объем пробы воздуха, отобранный для
анализа, приведенный
20
к
стандартным (давление 760 мм
рт. ст., температура 20 °С)
условиям:
V = 0,386 х Р
х u t / (273 + Т),
20
где:
Т - температура
воздуха при отборе
пробы (на входе
в
аспиратор), град. С;
Р - атмосферное давление при отборе пробы, мм рт. ст.;
u -
расход воздуха при
отборе пробы, куб. дм/мин.;
t -
длительность отбора пробы, мин.
Примечание:
Идентификация и расчет концентрации флуазинама в пробах могут быть проведены с
помощью программ обработки хроматографических данных с применением компьютера,
включенного в аналитическую систему.
10.
Оформление результатов измерений
_
За результат
анализа (Х) принимается среднее
арифметическое
_
результатов двух параллельных определений Х и Х (Х
= (Х + Х ) /
1 2 1
2
2),
расхождение между которыми не превышает значений норматива
оперативного контроля сходимости (d): |Х - Х | <= d:
1 2
_
d = d х Х / 100, мг/куб. м,
отн.
где:
d -
норматив оперативного контроля сходимости, мг/куб. м;
d - норматив
оперативного контроля сходимости, % (равен
отн.
10%).
Результат
количественного анализа представляют в виде:
_
-
результат анализа Х (мг/куб. м),
характеристика погрешности
_
дельта, %, Р = 0,95, или Х
+/- ДЕЛЬТА, мг/куб. м, Р = 0,95, где:
_
дельта х Х
ДЕЛЬТА = ----------, мг/куб. м.
100
Результат измерений
должен иметь тот же десятичный разряд, что и погрешность.
11.
Контроль погрешности измерений
Оперативный
контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в
соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества
результатов количественного химического анализа.
12.
Разработчики
Юдина Т.В.,
Федорова Н.Е., Волкова В.Н. (Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф.
Эрисмана, г. Мытищи Московской обл.).